I. Principes du Western Blot
Le Western Blot (WB), ou immunoblot protéique, est une technique classique de détection de protéines spécifiques basée sur les interactions antigène-anticorps, largement utilisée en biologie moléculaire, en immunologie et dans les domaines connexes. Ses principales étapes comprennent :
- Séparation des protéines:
- La SDS-PAGE sépare les protéines dénaturées par poids moléculaire.
- Le SDS enrobe les protéines d’une charge négative uniforme, éliminant ainsi les influences structurelles.
- Transfert membranaire:
- Les protéines sont transférées du gel vers une membrane (par exemple, PVDF ou nitrocellulose).
- Détection d'anticorps:
- Les anticorps primaires se lient spécifiquement à la protéine cible, suivis d'anticorps secondaires conjugués à une enzyme (par exemple, HRP) qui génèrent un signal détectable, tel que la chimioluminescence.
II. Flux de travail standard du Western Blot
| Étape | Procédures clés | Réactifs recommandés ( |
| 1. Préparation des échantillons | Extraire les protéines avec le tampon de lyse RIPA ; ajouter du PMSF pour inhiber les protéases activité. | Série de tampons de lyse RIPA, PMSF |
| 2. Quantification des protéines | Utiliser la méthode BCA (Cat#20200ES) pour la quantification ; faire correspondre le tampon de dilution standard au tampon d'échantillon. | Kits de quantification BCA (Cat#20200ES/20201ES) |
| 3. Électrophorèse SDS-PAGE | Utilisez des gels pré-coulés, faites fonctionner à 150 V jusqu'à ce que le colorant atteigne le fond du gel. | Gels pré-coulés, tampon de chargement SDS-PAGE |
| 4. Transfert et blocage membranaires | Activer la membrane PVDF (Cat#36125ES) en trempant dans du méthanol pendant 1 min ; transférer à 300 mA pendant 60 min dans un bain de glace ; bloquer à température ambiante (TA) pendant 1 h ou utiliser une solution de blocage rapide (Cat#36122ES) pendant 10 min. | TrTampon ansfer, série de membranes PVDF |
| 5. Incubation des anticorps | Incuber avec l'anticorps primaire à 4°C pendant la nuit ; l'anticorps secondaire à température ambiante pendant 1 à 2 h ; laver soigneusement avec du TBST 3x. | Diluant d'anticorps |
| 6.Détection de protéines | Développer avec ECL (Cat#36208ES). | Série de chimiluminescence ECL |
Figure 1 : Flux de travail du Western Blot
III. Problèmes courants et solutions
| Problème | Causes possibles | Solutions |
| Contexte élevé  | Blocage incomplet | Utilisez une solution de blocage fraîche et prolongez le temps de blocage. |
| Lavage inadéquat | Augmentez la fréquence et la durée du lavage pour éliminer la liaison non spécifique. | |
| Concentration excessive d'anticorps primaires | Diluer l’anticorps à une concentration appropriée. | |
| Problèmes de qualité des échantillons | Vérifiez la pureté et la qualité des échantillons ; utilisez des échantillons frais. | |
| Séchage par membrane | Assurez-vous que la membrane reste hydratée pendant les étapes d'incubation ; assurez-vous d'un contact complet avec les solutions de réaction. | |
| Signal faible ou inexistant  | Transfert incomplet | Vérifiez l’efficacité du transfert et ajustez le temps si nécessaire. |
| Membrane PVDF non activée | Faire tremper le PVDF dans du méthanol pour l'activer avant de le transférer dans le tampon. | |
| Incompatibilité des anticorps primaires avec les espèces cibles | Consultez la fiche technique, comparez les séquences immunogènes et protéiques et incluez un contrôle positif largement utilisé (par exemple, la β-actine dans les cellules de mammifères). | |
| Incompatibilité des anticorps primaires et secondaires | Assurez-vous que l’anticorps secondaire correspond à l’espèce hôte de l’anticorps primaire. | |
| Liaison insuffisante des anticorps | Augmenter la concentration en anticorps et prolonger l’incubation à 4°C (par exemple, pendant la nuit). | |
| Faibles niveaux d'antigènes | Chargez au moins 20 à 30 μg de protéines par voie ; utilisez des inhibiteurs de protéase et un contrôle positif. | |
| Faible expression de la protéine cible | Confirmer l’expression dans l’échantillon via la littérature/base de données ; concentrer l’échantillon ou utiliser un contrôle à forte expression. | |
| Bandes non spécifiques/bandes multiples  | Lignées cellulaires surpassées modifiant les profils protéiques | Utilisez des cellules à faible passage (< 15 passages) et exécutez des contrôles parallèles avec des stocks à passage précoce. |
| Dégradation des protéines | Inclure les inhibiteurs de protéase dans le tampon de lyse ; conserver à -80 °C, éviter la congélation-décongélation, utiliser des échantillons frais. | |
| Modifications post-traductionnelles | Consultez la littérature pour connaître les modifications affectant la taille de la bande (par exemple, ubiquitination, glycosylation). | |
| Plusieurs variantes d'épissure | Vérifier les variantes d’épissage via la littérature ou les bases de données. | |
| dimères/multimères de protéines | Ajoutez du β-mercaptoéthanol frais ou du DTT au tampon de chargement SDS. | |
| Contamination protéique exogène | Vérifiez la présence de protéines exogènes ; changez de lignée cellulaire si nécessaire. | |
| Chargement excessif de l'échantillon | Optimiser le chargement (20-30 μg) en fonction de l'expression cible via des tests de gradient. | |
| Formation de multimères | Faire bouillir les échantillons pendant 10 minutes pour dissocier les multimères | |
| Concentration élevée d'anticorps primaires | Réduisez la concentration et/ou le temps d’incubation pour éviter les bandes supplémentaires. | |
| Concentration élevée d'anticorps secondaires | Réduisez la concentration et incluez un contrôle secondaire uniquement pour réduire la liaison non spécifique. | |
| Détection de protéines ou de membres de la famille non signalés | Consultez la littérature ou BLAST ; utilisez les lignées cellulaires/tissus recommandés. | |
| Si cela est vérifié, vous avez peut-être découvert une nouvelle protéine ! | ||
| Bandes souriantes  | Migration rapide, température de tampon élevée, surcharge, tampon faible | Migration lente, tampon de pré-refroidissement, réduction de la charge protéique, garantie que le tampon recouvre complètement les puits. |
| Bandes froncées  | Problèmes d'appareil (par exemple, bulles sous le gel) | Ajustez la configuration pour éliminer les bulles et assurer une polymérisation uniforme du gel. |
| Bandes de queue  | Faible solubilité de l'échantillon, dégradation, tampon réutilisé | Bien mélanger les échantillons, utiliser des échantillons frais, préparer un tampon de marche frais. |
| Bandes en forme d'haltère  | Gel irrégulier polymérisation, échantillons impurs | Refondre le gel pour plus d'uniformité ; centrifuger les échantillons avant utilisation. |
| frottis de bande  | Charge excessive, mauvaise qualité du gel | Réduisez le volume de l’échantillon, améliorez la préparation du gel. |
| Traces de bulles  | Air emprisonné pendant le transfert | Éliminez les bulles lors de l'assemblage du sandwich de transfert. |
| Taches noires inégales  | Solution de blocage non dissoute, distribution inégale des anticorps | Dissoudre complètement la solution de blocage, laver 3 fois avec du TBST, agiter pendant l'incubation. |
| Taches blanches  | Substrat appauvrissant à forte concentration d'anticorps | Concentrations d’anticorps primaires/secondaires plus faibles. |
Ⅳ.Outils de sélection et d'optimisation des produits
Produits connexes:
| Procédures | Cat. N° | Nom du produit | Caractéristiques |
| Préparation des échantillons | 20101ES | Tampon de lyse RIPA (fort) | 100 ml |
| 20115ES | Tampon de lyse RIPA (moyen) | 100 ml | |
| 20114ES | Tampon de lyse RIPA (faible) | 100 ml | |
| 20118ES | Tampon de lyse pour les dosages WB/IP | 100 ml | |
| Kit de quantification des protéines BCA (amélioré) | 500 T/2500 T/5000 T | ||
| Kit de quantification des protéines BCA (prêt à l'emploi) | 500 T | ||
| Électrophorèse SDS-PAGE | Marqueur protéique à bande dorée plus 3 couleurs à plage régulière (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| Marqueur protéique à haute portée 3 couleurs GoldBand™ (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | Kit de préparation de gel SDS-PAGE | 1 kit (30~50 gels)/ 1 kit (150~250 gels) | |
| Kit de préparation rapide du gel PAGE | Concentrations : 8%, 10%, 12,5%, 15% | ||
| 36259ES-36280ES | Gel Protéine Plus Préfabriqué | Concentrations : 8 %, 10 %, 12 %, 4-12 %, 4-20 % Options de chargement du puits : 10 puits, 12 puits, 15 puits | |
|
Transfert et blocage membranaires | Membrane PVDF 0,45 μm (1 rouleau, 30 cm × 3 m) | 1 rouleau | |
| Membrane PVDF 0,22 μm (1 rouleau, 30 cm × 3 m) | 1 rouleau | ||
| Incubation des anticorps | 36206ES | Diluant d'anticorps primaires et secondaires pour WB | 100 mL/500 mL |
|
Détection de protéines | Réactif de détection Super ECL | 100 mL/500 mL | |
| Kit de substrat chimioluminescent ECL amélioré | 100 mL/500 mL |
V.Comment obtenir de l'aide
Pour un dépannage personnalisé ou une optimisation du protocole :
- Visite:
Yeasen Page produit Western Blot - E-mail: info@yeasenbio.com
Règle d'or pour réussir : Procédures standardisées + réactifs de haute qualité + validation étape par étape = résultats WB reproductibles !