अध्याय 1: पीसीआर प्रौद्योगिकी
1.1 पीसीआर के सिद्धांत
पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन), या पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन, डीएनए पॉलीमरेज़ को संदर्भित करता है एक टेम्पलेट के रूप में डीएनए के मूल स्ट्रैंड द्वारा उत्प्रेरित, विशिष्ट प्राइमर प्रारंभिक बिंदु के विस्तार के लिए, dNTP, Mg का जोड़2+ और विस्तार कारक, प्रवर्धन वृद्धि कारकों. विकृतीकरण, तापानुशीतन और विस्तार चरणों के माध्यम से, संतति स्ट्रैंड की इन विट्रो प्रतिकृति, मूल स्ट्रैंड टेम्पलेट डीएनए के लिए पूरक है, जो इन विट्रो में किसी भी लक्ष्य डीएनए को तेजी से और विशेष रूप से प्रवर्धित कर सकती है।
1.2 डीएनए पॉलीमरेज़ का वर्गीकरण
डीएनए पोल एक है के लिए महत्वपूर्ण एंजाइम सेलुलर डीएनए की प्रतिकृति। थर्मल स्थिरता, संश्लेषण क्षमता, गति, निष्ठा और विशेषता, इसे टैक डीएनए पोलीमरेज़, उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़, हॉट-स्टार्ट डीएनए पोलीमरेज़, प्रत्यक्ष-विस्तार डीएनए पोलीमरेज़, लंबे-खंडित डीएनए पोलीमरेज़ के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है एंजाइम, फास्ट डीएनए पॉलीमरेज़, मल्टीपल डीएनए पॉलीमरेज़ इत्यादि.
इनमें से सबसे आम है टैक डीएनए पॉलीमरेज़, जिसमें 5'→3' छोर पर पॉलीमरेज़ गतिविधि होती है और एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि 5'→3' छोर पर, लेकिन कोई नहीं 3'→5' अंत सुधार गतिविधि। Taq की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता इसकी अच्छी गर्मी प्रतिरोध है, जो थर्मल विकृतीकरण का सामना कर सकती है कदम पीसीआर काजिससे प्रक्रिया के बीच में अधिक एंजाइम जोड़ने की आवश्यकता नहीं रह जाती। हालाँकि, Taq की विश्वसनीयता कम है क्योंकि इसमें कोई प्रूफ़रीडिंग गतिविधि नहीं है। इसकी विश्वसनीयता मुख्य रूप से मैग्नीशियम आयनों और डीएनटीपी की सांद्रता और अनुपात द्वारा प्राप्त किया जाता है।
उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ में एक पोलीमराइज़ेशन केंद्र और एक दरार केंद्र होता है, पोलीमराइज़ेशन केंद्र में 5'→3' डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि होती है, जो उत्प्रेरित कर सकती है डीएनए का संश्लेषण 5'→3' की दिशा में; दरार केंद्र में 3'→5' एक्सोन्यूक्लिएज गतिविधि होती है, जो बेस मिसमैच की मरम्मत कर सकती है। इसलिए, टैक डीएनए पॉलीमरेज़ की विशेषताओं के अलावा, उच्च-निष्ठा डीएनए पॉलीमरेज़ में सुधारात्मक गतिविधि भी होती है, जो इसके लिए जिम्मेदार है काटना बेमेल न्यूक्लियोटाइड्स, इस प्रकार उत्पाद की सटीकता सुनिश्चित करते हैं.
ऊपर दिया गया चित्र दर्शाता है कि डीएनए पॉलीमरेज़ कैसे काम करता है [1].
डायरेक्ट पीसीआर (Direct PCR) एक प्रतिक्रिया जो पीसीआर प्रवर्धन और पशु परीक्षण के लिए अपरिष्कृत नमूनों का उपयोग करता है या प्रत्यक्ष प्रवर्धन के लिए पौधों के ऊतकों का उपयोग। वर्तमान में, येसेन प्रत्यक्ष पीसीआर किट का उपयोग पौधों, पशु ऊतकों, रक्त आदि जैसे कच्चे नमूनों के पीसीआर प्रवर्धन के लिए किया जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण की आवश्यकता के बिना, जो पीसीआर प्रयोगों की प्रक्रिया को बहुत सरल बनाता है।
उपरोक्त चित्र डायरेक्ट पीसीआर तकनीक को दर्शाता है।
एक। प्रत्यक्ष विधि: नमूने की थोड़ी मात्रा लें और इसे सीधे पीसीआर में डालें पीसीआर पहचान के लिए मास्टर मिक्स;
बी. लिसिस विधि: नमूना लेने के बाद, जीनोम को मुक्त करने के लिए इसे लाइसिस घोल में मिलाएं, लाइसिस सुपरनैटेंट की थोड़ी मात्रा लें और पीसीआर पहचान के लिए इसे पीसीआर मास्टर मिक्स में मिलाएं।
1.3 अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न और समाधान
| मुश्किल | कारण | समाधान |
| बिना प्रवर्धित बैंड के | इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रणाली की समस्याएं | न्यूक्लिक एसिड डाई, जेल सांद्रता और इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर का समस्या निवारण करें। |
| गलत विकृतीकरण तापमान | क्या पीसीआर उपकरण का संकेतित तापमान वास्तविक तापमान के अनुरूप है? यदि तापमान बहुत अधिक है, तो एंजाइम तेजी से नष्ट हो जाता है पहले कुछ चक्रों में; यदि यह बहुत कम है, तो टेम्पलेट विकृतीकरण पूरा नहीं हुआ है। | |
| प्रतिक्रिया प्रणाली में प्रोटीएज़ और न्यूक्लिऐज़ का संदूषण | टैक एंजाइम मिलाने से पहले प्रतिक्रिया प्रणाली को 95°C पर 5-10 मिनट तक गर्म किया जाना चाहिए। | |
| पीरिमर त्रुटि | BLAST का उपयोग करके प्राइमर की विशिष्टता की जाँच करें या प्राइमर को पुनः डिज़ाइन करें। | |
| टेम्पलेट में अशुद्धियाँ हैं | विशेष रूप से, फॉर्मेल्डिहाइड-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों में अक्सर फॉर्मिक एसिड होता है, जो डीएनए डिप्यूरिनेशन का कारण बनता है और पीसीआर परिणामों को प्रभावित करता है। | |
| प्राइमर का क्षरण और विफलता | पुष्टि करें कि सिंथेटिक प्राइमर सही हैं, शुद्ध हैं, या अनुचित भंडारण स्थितियों के कारण निष्क्रिय हो गए हैं। | |
| पीसीआर उत्पाद की कम मात्रा | अनुपयुक्त एनीलिंग तापमान | 2 डिग्री के ग्रेडिएंट के साथ एनीलिंग तापमान को अनुकूलित करने के लिए एक ग्रेडिएंट पीसीआर प्रतिक्रिया डिजाइन की गई थी। |
| डीएनए टेम्पलेट में अवरोधकों की उपस्थिति | सुनिश्चित करें कि डीएनए टेम्प्लेट साफ़ हो। | |
| दीर्घकालीन विकृतीकरण | लम्बे समय तक विकृतीकरण से डीएनए पॉलीमरेज़ निष्क्रिय हो जाता है। | |
| एक्सटेंशन बहुत छोटा है | एक्सटेंशन समय बहुत कम है। एक्सटेंशन समय को 1kb/min के सिद्धांत पर सेट करें। | |
| डीएनए टेम्पलेट की मात्रा बहुत कम है | डीएनए टेम्पलेट की मात्रा बढ़ाएँ. | |
| प्राइमर की अपर्याप्त मात्रा | सिस्टम में प्राइमर सामग्री बढ़ाएँ. | |
| पीसीआर चक्रों की अपर्याप्त संख्या | प्रतिक्रिया चक्रों की संख्या बढ़ाएँ. | |
| एकाधिक बैंड | खराब प्राइमर विशिष्टता | प्राइमर डिजाइन सॉफ्टवेयर जैसे कि BLAST और प्राइमर का उपयोग प्राइमर विशिष्टता की जांच करने या प्राइमरों को पुनः डिजाइन करने के लिए किया गया। |
| लूपों की अत्यधिक संख्या | टेम्पलेट की मात्रा उचित रूप से बढ़ाएँ, और चक्रों की संख्या कम करें। | |
| बहिर्जात डीएनए संदूषण | स्वच्छ संचालन सुनिश्चित करें। | |
| टेम्पलेट्स की अत्यधिक मात्रा | प्लास्मिड डीएनए की मात्रा <50ng होनी चाहिए, जबकि जीनोमिक डीएनए की मात्रा <200ng होनी चाहिए। | |
| बहुत अधिक प्राइमर | प्रतिक्रिया प्रणाली में प्राइमरों की मात्रा कम करें। | |
| प्रतिक्रिया समाधान अच्छी तरह से मिश्रित नहीं है | सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया बफर पूरी तरह पिघल गया है और अच्छी तरह मिश्रित हो गया है। | |
| मिलीग्राम बहुत ज़्यादा गाड़ापन | उपयोग किये जाने वाले Mg की सांद्रता को उचित रूप से समायोजित करें। | |
| एंजाइम की उच्च खुराक या एंजाइम की खराब गुणवत्ता | एंजाइम की मात्रा कम करें या उसे किसी अन्य स्रोत से बदलें। | |
| कम एनीलिंग तापमान, लंबा एनीलिंग और विस्तार समय | विकृतीकरण और विस्तार समय को कम करने के लिए एनीलिंग तापमान बढ़ाएं, या एनीलिंग तापमान को अनुकूलित करने के लिए ग्रेडिएंट पीसीआर प्रतिक्रिया डिजाइन करें। | |
| पीसीआर मिश्रण में ही समस्याएं | यदि यह पीसीआर प्रीमिक्स है, तो यह अभिकर्मक की गुणवत्ता हो सकती है, बैच या अन्य ब्रांडों को बदलने की सिफारिश की जाती है। | |
| ग़लत आकार | सीआसंजन | बेंच को नये अभिकर्मकों और टिप्स से साफ करें। |
| टेम्पलेट्स या प्राइमर्स का गलत उपयोग | प्राइमर और टेम्पलेट्स बदलें. | |
| जीएनोटाइप | अध्ययन किये गए जीनों पर अनुक्रम विश्लेषण और BLAST अध्ययन किये गए। |
अध्याय 2: न्यूक्लिक एसिड वैद्युतकणसंचलन
2.1 न्यूक्लिक एसिड वैद्युतकणसंचलन के सिद्धांत
विद्युत क्षेत्र की क्रिया के तहत आवेशित कणों का उनके विद्युत गुणों के विपरीत इलेक्ट्रोड की ओर गति करना वैद्युतकणसंचालन कहलाता है। विद्युत क्षेत्र में आवेशित कणों का उपयोग करना अलग-अलग गति से आगे बढ़ना और तकनीक का पृथक्करण प्राप्त करना वैद्युतकणसंचलन कहलाता है। न्यूक्लिक एसिड वैद्युतकणसंचलन एक है महत्वपूर्ण उपकरण न्यूक्लिक एसिड अनुसंधान के लिए और एक तकनीकों का अभिन्न अंग जैसे न्यूक्लिक एसिड जांच, न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन और अनुक्रम विश्लेषण। न्यूक्लिक एसिड वैद्युतकणसंचलन आमतौर पर किया गया एगरोज़ में या पॉलीएक्रिलामाइड जैल। विभिन्न सांद्रता एगरोज और पॉलीएक्रिलामाइड विभिन्न आणविक छलनी जाल आकार वाले जैल बना सकते हैं, जिनका उपयोग विभिन्न आणविक भार के न्यूक्लिक एसिड टुकड़ों को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
2.2 एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन
एगरोज़ समुद्री शैवाल से निकाला जाने वाला एक रैखिक बहुलक है। एगरोज़ को बफर घोल में गर्म किया जाता है और एक स्पष्ट, पारदर्शी घोल में पिघलाया जाता है, जिसे फिर डाला जाता है जिलेटिन के सांचे में डाला जाता है और ठोस मैट्रिक्स बनाने के लिए जम जाता है जिसे जेल के रूप में जाना जाता है, जिसका घनत्व इस पर निर्भर करता है एगरोज़ की सांद्रता.
अगारोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन एक प्रकार की वैद्युतकणसंचलन विधि है जिसमें सहायक माध्यम के रूप में एगरोज़ का उपयोग किया जाता है, और के बीच मुख्य अंतर विश्लेषणात्मक सिद्धांत और अन्य समर्थन वैद्युतकणसंचलन है कि यह है दोहरी भूमिका "आणविक छलनी" और "वैद्युतकणसंचलन" का। जेल में रखा गया है विद्युत क्षेत्र, अंतर्गत की कार्रवाई विद्युत क्षेत्र, आवेशित न्यूक्लिक एसिड की ओर पलायन सकारात्मक खंभा के माध्यम से जाल का जेल. का मूल्य प्रवासन के आकार से प्रभावित होता है न्यूक्लिक एसिड अणु, एगरोज़ सांद्रता, लागू वोल्टेज, विद्युत क्षेत्र, वैद्युतकणसंचलन बफर, और एम्बेडेड डाई की मात्रा। इलेक्ट्रोफोर के उचित समय के बादएसहै अंतर्गत विभिन्न परिस्थितियाँ, विभिन्न आकार और संरचना वाले न्यूक्लिक एसिड के टुकड़े जेल पर अलग-अलग स्थिति में होंगे, जिससे पृथक्करण का उद्देश्य प्राप्त होगा।एगरोज़ जेल का पृथक्करण इसकी एक विस्तृत श्रृंखला है, जिसका उपयोग आमतौर पर डीएनए कटिंग जेल रिकवरी, डीएनए अलगाव में किया जाता है और यह समर्थन करने के लिए उपयोग किया जाता है कि क्या डीएनए पुनः संयोजक है, प्लास्मिड, आदि। प्लास्मिड काटा गया हो या नहीं, एगरोज़ जेल की विभिन्न सांद्रता की लंबाई से अलग किया जा सकता है 200बीपी को 50केबी का डीएनए टुकड़े टुकड़े।
2.3 प्रयोगात्मक विधियाँ
निर्माण गोंद
उदाहरण के तौर पर 1% सांद्रता लें: 1 ग्राम एगरोज़ का वजन करें, इसे 250 मिली शंक्वाकार फ्लास्क में डालें, 100 मिली 0.5×TBE इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर डालें और इसे अच्छे से मिला लें, इसे माइक्रोवेव ओवन में उबालें और फिर इसे लगभग 60 डिग्री सेल्सियस तक हवा में सुखाएं, इसमें उचित मात्रा में न्यूक्लिक एसिड डाई मिलाएं और इसे अच्छी तरह हिलाएं और फिर इसे पहले से तैयार साफ जेल प्लेट में डालें, दोनों हाथों से कंघी लें जेल समाधान में लंबवत डालें, और प्रतीक्षा करें जेल होना इसे प्राकृतिक रूप से ठंडा किया जाता है जब तक कि यह पूरी तरह से ठोस न हो जाए (25-30 मिनट)।
गोंद बनाने वाली कंघी हटाएँ
जेल को इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें (या तो जेल ट्रे के साथ या सिर्फ जेल के साथ)), सैंपल वेल साइड को नेगेटिव पोल में रखें, और 0.5× TBE जोड़ें इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर में तब तक रखें जब तक जेल लगभग 1 मिमी नीचे न आ जाए।
जोड़ना नमूना
10× लोडिंग बफर जोड़ें (लोडिंग बफर) डीएनए नमूनों के लिए, अच्छी तरह से मिलाएं, और फिर धीरे-धीरे नमूना मिश्रण को सूप में डालेंबीमर्ज जेल कुओं पिपेट गन के साथ, प्रति वेल 5-10 μL सैंपल मिलाते हुए (40 μL से अधिक नहीं)। आम तौर पर, पहले वेल को डीएनए मार्कर से भरा जाना चाहिए, दूसरे को पॉजिटिव कंट्रोल (परिभाषित डीएनए) से), और तीसरा नकारात्मक नियंत्रण (अभिकर्मक या पानी) के साथ), और नमूनों का क्रम दर्ज किया जाना चाहिए।
वैद्युतकणसंचलन
आवरण वैद्युतकणसंचलन टैंक, कनेक्ट करें तारों, बिजली चालू करें, और वैद्युतकणसंचलन वोल्टेज, करंट सेट करें और समय पैरामीटर। आम तौर पर, वोल्टेज 5 v/cm से अधिक नहीं होना चाहिए (लंबाई का संदर्भ है इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक के धनात्मक और ऋणात्मक ध्रुवों के बीच की दूरी), और वैद्युतकणसंचलन समय आम तौर पर होता है 15-30 मिनट.
वैद्युतकणसंचलन का अंत
निकालना जेल (जेल ट्रे के बिना) और एक स्पष्ट इलेक्ट्रोफोरेटिक छवि प्राप्त करने के लिए इसे यूवी इमेजिंग सिस्टम के तहत इमेज करें, फिर इलेक्ट्रोफोरेटिक छवि को संपादित करें छवि संपादन सॉफ्टवेयर के साथ और इसे नमूना जानकारी, दिनांक और ऑपरेटर के साथ लेबल करें।
2.4 अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न और समाधान
| मुश्किल | कारण | समाधान |
| लक्ष्य बैंड गायब | छोटे डीएनए का जेल खत्म हो गया | वैद्युतकणसंचलन समय को छोटा करें, वोल्टेज को कम करें, जेल एकाग्रता में वृद्धि करें। |
| समान अणुभार आकार के डीएनए बैंड को आसानी से पहचाना नहीं जा सकता | इष्टतम जेल सांद्रता से मेल खाने के लिए वैद्युतकणसंचलन समय बढ़ाएँ। | |
| लक्ष्य टुकड़ा पारंपरिक वैद्युतकणसंचलन के लिए बहुत बड़ा है। | स्पंदित जेल वैद्युतकणसंचलन पर विश्लेषण किया गया। | |
| कोई उद्देश्य क्लिप नहीं | पीसीआर प्रक्रिया दोषपूर्ण थी और लक्ष्य उत्पाद को प्रवर्धित नहीं कर सकी। | |
| धुंधले डीएनए बैंड | बासी वैद्युतकणसंचलन बफर | जब इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर का कई बार उपयोग किया जाता है, तो आयनिक शक्ति कम हो जाएगी, पीएच मान धीरे-धीरे बढ़ेगा, और फ्लशिंग क्षमता कमजोर हो जाएगी, जिससे इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रभाव प्रभावित होगा, इसलिए इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर को बार-बार बदलने की सिफारिश की जाती है। |
| डीएनए क्षरण | न्यूक्लिऐस संदूषण से बचें. | |
| उपयोग की जाने वाली वैद्युतकणसंचलन स्थितियाँ वैद्युतकणसंचलन के लिए उपयुक्त नहीं हैं | वैद्युतकणसंचलन वोल्टेज 20V/सेमी से अधिक नहीं होना चाहिए और तापमान <30°C होना चाहिए; विशाल डीएनए स्ट्रैंड के वैद्युतकणसंचलन का तापमान <15°C होना चाहिए; जाँच करें कि उपयोग किए गए वैद्युतकणसंचलन बफर में पर्याप्त बफरिंग क्षमता है या नहीं। | |
| अत्यधिक डीएनए नमूनाकरण | जेल में डीएनए के अप-सैंपल की मात्रा कम करें। | |
| डीएनए नमूने बहुत नमकीन हैं | इलेक्ट्रोफोरेसिस से पहले इथेनॉल अवक्षेपण द्वारा अतिरिक्त नमक को हटा दिया गया। | |
| प्रोटीन संदूषण | वैद्युतकणसंचालन से पहले फिनोल निष्कर्षण से प्रोटीन को हटा दिया जाता है। | |
| नमूना सांद्रता बहुत अधिक है | ऊपरी नमूने की सांद्रता 500 एनजी / वेल से कम होनी चाहिए, सांद्रता बहुत अधिक होने से वैद्युतकणसंचलन की गति प्रभावित होगी, चलने पर, खींचने और धुंधला होने के परिणामस्वरूप। | |
| कमज़ोर या कोई बैंड नहीं | डीएनए का नमूना आकार अपर्याप्त | डीएनए अवशोषण की मात्रा में वृद्धि |
| डीएनए क्षरण | डीएनए के न्यूक्लिऐस संदूषण से बचना | |
| न्यूक्लिक एसिड रंगों के लिए अनुपयुक्त प्रकाश स्रोत | न्यूक्लिक एसिड डाई के लिए निर्देशों के अनुसार उपयुक्त तरंगदैर्ध्य प्रकाश स्रोत का चयन करें। | |
| बैंड गैर-पृथक | समय की कमी | वैद्युतकणसंचलन समय बढ़ाएँ |
| गलत जेल सांद्रता | गोंद की सांद्रता बहुत अधिक है, जिसके परिणामस्वरूप पृथक्करण में बहुत अधिक प्रतिरोध होता है। | |
| नमूने में नमक आयनों की सांद्रता बहुत अधिक है | नमक आयनों की उच्च सांद्रता इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रतिरोध को बढ़ाती है और बैंडों के पृथक्करण को रोकती है, उदाहरण के लिए, एंडोन्यूक्लिऐस बफर युक्त पचाए गए नमूने। | |
| गैर-विशिष्ट बैंड | आरएनए संदूषण | नमूनों की पुनः तैयारी |
| नमूनों के बीच संदूषण | भरने के दौरान टिप को बदलना; 40 μl से अधिक आयतन वाले नमूनों को फैलने से बचाना। |
2.5 पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन
पॉलीएक्रिलामाइड जैल एक्रिलामाइड मोनोमर, चेन पॉलीमराइजेशन उत्प्रेरक N,N,N',N'-टेट्रामेथिलएथिलीनडायमाइन (TEMED) और अमोनियम परसल्फेट, और क्रॉस-लिंकिंग एजेंट N,N'-मेथिलीनबिसएक्रिलामाइड के बीच रासायनिक प्रतिक्रिया द्वारा बनते हैं। एक्रिलामाइड मोनोमर उत्प्रेरक की उपस्थिति में पॉलीमराइज़ होकर लंबे समय तक बनता है जंजीरें, जो हैं क्रॉस से जुड़े द्वारा जेल बनाने के लिए एक क्रॉस-लिंकिंग एजेंट, जिसके छिद्र का आकार चेन की लंबाई और क्रॉस-लिंकिंग की डिग्री से निर्धारित होता है। छिद्र का आकार चेन की लंबाई और क्रॉस-लिंकिंग की डिग्री. चेन की लंबाई इस पर निर्भर करती है एक्रिलामाइड की सांद्रता, और बहुलक के क्रॉस-लिंकिंग की डिग्री को एक्रिलामाइड और क्रॉस-लिंकिंग एजेंट के अनुपात को समायोजित करके बदला जा सकता है.
पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग किया जा सकता है अलग नमूने पर आधारित में मतभेद शुल्क, आणविक आकार और आकृति इलेक्ट्रोफोरेस्ड नमूने. यह आणविक छलनी और इलेक्ट्रोस्टैटिक को जोड़ती है , और इसमें एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन की तुलना में उच्च संकल्प शक्ति होती है। डीएनए टुकड़े केवल से भिन्न एक न्यूक्लियोटाइड अलग किया जा सकता है.
पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग 1 केबी से कम लंबाई वाले डीएनए टुकड़ों का विश्लेषण और तैयार करने के लिए किया जाता है। का आकार पृथक किये जाने वाले न्यूक्लिक एसिड के टुकड़े, जैल के अलग तैयार किया जा सकता है.
एक्रिलामाइड और डीएनए की विभिन्न सांद्रताओं के लिए प्रभावी पृथक्करण सीमा नीचे दी गई तालिका में दर्शाई गई है:
| सान्द्र (%) | प्रभावी पृथक्करण सीमा (बीपी) |
| 3.5 | 100 से 2000 |
| 5 | 80 से 500 |
| 8 | 60 से 400 |
| 12 | 40 से 200 |
| 15 | 25 से 150 |
| 20 | 10 से 100 |
2.4 संबंधित उत्पादों के चयन के लिए दिशानिर्देश
पारंपरिक पी.सी.आर. | ||||
| विनिर्देश | 10167ईएस | 10102ईएस | 10103ईएस | 10108ईएस |
| प्रवर्धन लंबाई | ≤10-15 केबी | ≤5 केबी | ≤5 केबी | ≤4 केबी |
| विस्तार समय | 1-10 सेकंड/केबी | 30 सेकंड/केबी | 30 सेकंड/केबी | 30 सेकंड/केबी |
| उत्पाद अंत संरचना | 3'-डीए | 3'-डीए | 3'-डीए | 3'-डीए |
| एनीलिंग तापमान | 60℃ | टीएम-(2~5)℃ | टीएम-(2~5)℃ | टीएम-(2~5)℃ |
| जीसी संगतता रेंज | 30-70% | 40-70% | 40-70% | 30-70% |
| 5'-3' एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि | उपस्थित | उपस्थित | उपस्थित | उपस्थित |
| कॉलोनी पीसीआर | उपयुक्त | उपयुक्त | उपयुक्त | उपयुक्त |
| जीन पहचान | उपयुक्त | उपयुक्त | उपयुक्त | उपयुक्त |
| मल्टीप्लेक्स पीसीआर | उपयुक्त नहीं | उपयुक्त नहीं | उपयुक्त नहीं | 3-4 प्लेक्स पी.सी.आर. |
| वैद्युतकणसंचलन सूचक | बैंगनी-लाल | नीला | रंगहीन | नीला |
| ठोस शुरुआत | ठोस शुरुआत | गर्म प्रारंभ नहीं | गर्म प्रारंभ नहीं | ठोस शुरुआत |
| प्री-मिक्स/किट | पूर्व मिक्स | पूर्व मिक्स | पूर्व मिक्स | पूर्व मिक्स |
प्रत्यक्ष पी.सी.आर. | ||||
| विनिर्देश | 10185ईएस | 10188ईएस | 10187ईएस | |
| उत्पाद का प्रकार | माउस प्रत्यक्ष प्रवर्धन | रक्त प्रत्यक्ष प्रवर्धन | प्लांट डायरेक्ट एम्पलीफिकेशन | |
| प्रवर्धन लंबाई | ≤1 केबी | ≤8 केबी | ≤1 केबी | |
| विस्तार समय | 30 एस/केबी | 3-5 एस/केबी ≤2 केबी के लिए, | 60 एस/केबी | |
| ≤8 kb के लिए 10 s/kb | ||||
| नमूना लिसिस समय | 15 मिनट | 0-3 मिनट | 0-10 मिनट | |
| उत्पाद अंत संरचना | कुंद अंत | कुंद अंत | कुंद अंत | |
| एनीलिंग तापमान | टीएम-(2~5)℃ | टीएम-(1~2)℃ | टीएम-(2~5)℃ | |
| जीसी संगतता रेंज | 30-70% | 30-75% | 40-65% | |
| 5'-3' एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि | √ | √ | √ | |
| जीन पहचान | √ | √ | √ | |
| मल्टीप्लेक्स पीसीआर | 3-4 प्लेक्स | |||
| प्रत्यक्ष नमूना प्रवर्धन | √ | √ | √ | |
| वैद्युतकणसंचलन सूचक | नीला | रंगहीन | नीला | |
| ठोस शुरुआत | √ | √ | √ | |
| प्री-मिक्स/किट | किट (मिश्रण के साथ) | किट (मिक्स + बफर के साथ) | किट (मिश्रण के साथ) | |
| उपयुक्त जीव | मूषक चूहा | मानव, चूहा, बकरी, मुर्गी, सुअर, आदि। | चावल, मक्का, तम्बाकू, रेपसीड, गेहूं, सोयाबीन, आदि। | |
| उपयुक्त ऊतक/सामग्री | पूंछ, कान, पैर का अंगूठा (मांसपेशियों सहित) और अन्य अंग | EDTA, हेपरिन, साइट्रेट आदि युक्त ताजा रक्त, प्रशीतित (जमे हुए) रक्त, वाणिज्यिक सूखे रक्त धब्बे | युवा पत्ते, पुराने पत्ते, पौधे, युवा तने | |
| नमूना इनपुट | ऊतक: 5-10 मिलीग्राम; पूंछ: 1-5 मिमी | संपूर्ण रक्त: 0.5%-20%, सूखा रक्त धब्बा: 1 mm² | पत्ती: 1-10 मिमी, बीज: 1-3 मिमी | |
उच्च-निष्ठा पी.सी.आर. | ||||
| विनिर्देश | 10164ईएस | 10153ईएस | 10154ईएस | |
| प्रवर्धन लंबाई | ≤10 केबी जीडीएनए, ≤10 केबी सीडीएनए, ≤16 केबी λDNA | ≤10 केबी जीडीएनए, ≤10 केबी सीडीएनए, ≤13 केबी λDNA | ≤10 केबी जीडीएनए, ≤10 केबी सीडीएनए, ≤13 केबी λDNA | |
| विस्तार समय | 5 सेकंड/केबी | 30 सेकंड/केबी | 30 सेकंड/केबी | |
| निष्ठा (Taq) | 83× | 83× | 83× | |
| उत्पाद अंत संरचना | कुंद अंत | कुंद अंत | कुंद अंत | |
| एनीलिंग तापमान | 60℃ | 68℃ | 68℃ | |
| जीसी संगतता रेंज | 20-80% | 30-60% | 30-60% | |
| 5'-3' एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि | अनुपस्थित | अनुपस्थित | अनुपस्थित | |
| वैद्युतकणसंचलन सूचक | नीला | रंगहीन | नीला | |
| एकल एंजाइम/प्री-मिक्स | पूर्व मिक्स | एकल एंजाइम | पूर्व मिक्स | |
| सहनशीलता | / | / | रक्त, माउस ऊतक लाइसेट | |
न्यूक्लिक एसिड वैद्युतकणसंचलन | ||||
| उत्पाद श्रेणी | बिल्ली नं. | प्रोडक्ट का नाम | आवेदन | |
| अगारोज़ | 10208ईएस | अगारोज़ | नियमित न्यूक्लिक एसिड वैद्युतकणसंचलन | |
| 10221ईएस | उच्च छनाई वाला एगरोज़ (पीसीआर ग्रेड) | 20 बीपी-800 बीपी के डीएनए टुकड़ों को अलग करने के लिए उपयुक्त, पॉलीएक्रिलामाइड जेल के बराबर | ||
| 10226ईएस | अगारोज़ गोलियाँ (0.5 ग्राम/गोली) | नियमित एगरोज़ अनुप्रयोगों के लिए सुविधाजनक | ||
| न्यूक्लिक एसिड डाई | 10202ईएस | येआर्ड न्यूक्लिक एसिड जेल स्टेन (पानी में 10,000×) | जल में घुलनशील, EB के समान वर्णक्रमीय गुणों वाला, 300 nm UV प्रकाश पर उत्तेजनीय | |
| डीएनए मार्कर | 10510ईएस | गोल्डबैंड 1 केबी डीएनए लैडर | 250-12000 बी.पी. (13 बैंड) | |
| 10515ईएस | गोल्डबैंड 50 बीपी डीएनए लैडर | 50-1000 बी.पी. (14 बैंड) | ||
| 10507ईएस | गोल्डबैंड 100बीपी डीएनए लैडर | 100-1500 बी.पी. (12 बैंड) | ||
| 10516ईएस | गोल्डबैंड 100 बीपी प्लस डीएनए लैडर | 100-3000 बी.पी. (14 बैंड) | ||
| 10517ईएस | गोल्डबैंड 200 बीपी डीएनए लैडर | 200-5000 बी.पी. (12 बैंड) | ||
| 10518ईएस | गोल्डबैंड 500 बीपी डीएनए लैडर | 500-5000 बी.पी. (8 बैंड) | ||
| 10501ईएस | गोल्डबैंड DL2000 डीएनए मार्कर | 100-2000 बी.पी. (6 बैंड) | ||
| 10504ईएस | गोल्डबैंड DL5000 डीएनए मार्कर | 100-5000 बी.पी. (9 बैंड) | ||
| 10505ईएस | गोल्डबैंड DL10,000 डीएनए मार्कर | 100-10000 बी.पी. (10 बैंड) | ||
| 10511ईएस | गोल्डबैंड पूर्ण-स्केल डीएनए सीढ़ी | 100-12000 बी.पी. (20 बैंड) | ||
| 10512ईएस | गोल्डबैंड DL15000 डीएनए मार्कर | 250-15000 बी.पी. (7 बैंड) |
2.5 न्यूक्लिक एसिड इलेक्ट्रोफोरेसिस उत्पादों (पी) का उपयोग करके प्रकाशनआर्टियल)
[1] लुओ जे, यांग क्यू, झांग एक्स, एट अल. टीएफपीआई हाइपरवायरुलेंट क्लेड 2 सी. डिफिसाइल से टीसीडीबी के लिए एक कोलोनिक क्रिप्ट रिसेप्टर है। सेल. 2022;185(6):980-994. ई15. doi:10.1016/j.cell.2022.02.010 (आईएफ:41.584)
[2] हुआंग एन, चेन एच, गोंग एच, एट अल. सेहेड, तनाव-उत्पन्न हाइड्रोजन पेरॉक्स के साथ एक उपन्यास जीन अभिव्यक्ति प्रणाली आईडीई उन्मूलन गुण और एंटी-एजिंग प्रभाव। सिग्नल ट्रांसडक्शन और लक्षित थेरेपी। 2022, 7, 235. doi: 10.1038/s41392-022-01047-2. (आईएफ: 38.1)
[3] झांग सी, झोउ बी, गु एफ, एट अल. माइक्रोपेप्टाइड पीएसीएमपी अवरोधन सिंथेटिक घातक प्रभाव उत्पन्न करता है सीटीआईपी को कम करके और पॉली(ADP-राइबोसिल) आयन. मोल सेल. 2022;82(7):1297-1312.e8. doi:10.1016/j.molcel.2022.01.020 (IF:17.970)
[4] झू एम, दाईएक्स. परिवर्तित (पी) पीपीजीपी स्तरों द्वारा वृद्धि दमन गैर-इष्टतम से परिणाम संसाधन आवंटन एस्चेरिचिया कोली. न्यूक्लिक एसिड रेस. 2019;47(9):4684-4693. doi:10.1093/nar/gkz211 (आईएफ:11.147)
[5] रिज़वान एचएम, झिमिन एल, हरसोनोवातीडब्ल्यू, एट अल. कटाई के बाद नियंत्रण के लिए फंगल रोगजनकों की पहचान पैशन फ्रूट (पैसिफ्लोरा एडुलिस) क्षय और मल्टी-ओमिक्स तुलनात्मक पथ विश्लेषण से पता चलता है बैंगनी रंग ज़्यादा प्रतिरोधी है पीले कल्टीवेर की तुलना में रोगजनकों के लिए अधिक प्रतिरोधी। j Fungi (Basel). 2021;7(10):879. 2021 अक्टूबर 19 को प्रकाशित। doi:10.3390/jof 7100879 (आईएफ:5.816)
[6] LiT, झोउ बी, लुओ जेड, एट अल. संरचनात्मक लक्षण वर्णन नैनोबॉडी को व्यापक गतिविधि के साथ बेअसर करना SARS-CoV-2 वेरिएंट। फ्रंट माइक्रोबायोल। 2022;13:875840. प्रकाशित 2022 जून2. doi:10.3389/fmicb.2022.875840 (आईएफ:5.640)
[7] वांग टी, रेन डी, गुओ एच, एट अल. सीजीएससीडी1 मेलेनिन जैवसंश्लेषण और रोगजनकता के लिए आवश्यक है कोलेटोट्राइकम का ग्लोओस्पोरियोइड्स. रोगजनकों. 2020;9(2) :141. प्रकाशित 2020 फ़रवरी 20. doi:10.3390/pathogens9020141(IF:3.018) :141. प्रकाशित 2020 फ़रवरी 20. doi:10.3390/पैथोजेन्स9020141 (आईएफ:3.018)
[8] ल्व वाई, लीएक्स, झांग एच, ज़ोउ एफ, शेन बी. डेल्टामेथ्रिन-संवेदनशील और -प्रतिरोधी में CircRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल
पिपियंस पैलेन्स (डिप्टेरा: कुलिसिडे)। कॉम्प बायोकेम फिजियोल बी बायोकेम मोल बायोल. 2022;261:110750. doi:10.1016 /j.cbpb.2022.110750 (आईएफ:2.231)
[9] हू एम, दाईएक्स. परिवर्तित (पी) पीपीजीपी द्वारा वृद्धि दमन स्तरों में गैर-इष्टतम संसाधन आवंटन का परिणाम है एस्चेरिचिया कोली[जे]. न्यूक्लिक एसिड रिसर्च, 2019, 47(9): 4684-4693.(आईएफ11.6)
[10] गुओ एल, यांग डब्ल्यू, हुआंग क्यू, एट अल. सेलेनोसिस्टीन-विशिष्ट द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री ऊतक-विशिष्ट सेलेनोप्रोटीन और उम्मीदवार सेलेनोप्रोटीन का खुलासा करती है [जे]। सेल केमिकल जीवविज्ञान, 2018, 25(11): 1380-1388. ई4. (आईएफ6.762)
2.6 पीसीआर उत्पादों का उपयोग करके प्रकाशन (आंशिक)
[1] वांग वाई, फू जेड, लिक्स, एट अल. कोशिकाद्रव्यी डीएनए संवेदन द्वारा केयू जटिल में वृद्ध सीडी4+ टी कक्ष शक्ति प्रदान करता है टी कक्ष एक्टिवा विषय और उम्र बढ़ने से संबंधित स्व-प्रतिरक्षित सूजन. प्रतिरक्षा. 2021;54(4):632-647.e9. दोई:10.1016/j.immu
ni.2021.02.003(आईएफ:31.745)
[2] यांग एक्स, गाओ एफ, झांग डब्ल्यू, एट अल. "तारा" मिर-34ए और सीएक्ससीआर4 प्रतिपक्षी आधारित नैनोप्लेक्स के लिए बिनरय को-ऑपरेटिव प्रवास उपचार के खिलाफटी मेटास्टेटिक स्तन कैंसर. जे नियंत्रण रिलीज़. 2020;326:615-627. डोई:10.1016/जे. jconrel.2020.07.029(आईएफ:7.727)
[3] क़ियाओय, डू जे, जीई आर, एट अल. ए नमूना और खोज Microneedle पैबंद के लिए सोरायसिस माइक्रो RNA बायोमार्कर
विश्लेषण में मध्य तरल पदार्थ. गुदा केम. 2022;94(14):5538-5545. doi:10.1021/acs.analchem.1c04401(आईएफ:6.986)
[4] लिन क्यू,ये एक्स, हुआंग जेड, एट अल. ग्राफीन ऑक्साइड आधारित दमन का अविशिष्टता में लूप-मध्यस्थ आइसोथर कुप्रवर्धन संवेदनशील लोगों को सक्षम बनाना खोज साइक्लोऑक्सीजिनेज का-2 एमआरएनए में कोलोरेक्टल कैंसर. गुदा केम. 2019;91(24):15694-15702. डोई:10.1021/acs.analchem.9b03861(आईएफ:6.350)
[5] लिन क्यू, हुआंग जेड,ये एक्स, एट अल. प्रयोगशाला में ए नली: एकांत, निष्कर्षण, और हैअन्य प्रवर्धन का पता लगाने का एक्सोसोमल लंबा नॉनकोडिंग शाही सेना गैस्ट्रिक का कैंसर। तलंता। 2021;225:122090।
डोई:10.1016/j.tta.2021.122090(आईएफ:6.057)
[6] लियू सी, ज़ोउ जी, एट अल. 5-फॉर्मिल्यूरसिल जैसा ए मल्टीकार्यात्मक इमारत अवरोध पैदा करना में बायोसेंसर डिज़ाइन[जे]. एंजेव केम int यहाँ एड इंग्ल. 2018 जुलाई 26;57(31):9689-9693.（आईएफ 11.992）
[7] वैंग एम, झांग एस, झेंग जी, एट अल. लाभ-कार्य मुततआयन कार्ड14 का ओर जाता है अविरल सोरायसिस की तरह त्वचा सूजन बढ़ी केरेटिनकोशिका के जवाब आईएल-17ए. प्रतिरक्षा. 2018;49(1):66-79.e5.
doi:10.1016/j.immuni.2018.05.012(IF:19.734)
[8] झांग वाई, झंकार एच, वांग एक्स, एट अल. एमके2 को बढ़ावा देता है टीएफसीपी2एल1 निम्नीकरण के जरिए β-टीआरसीपी यूबीक्यूटिन एलइगासे को विनियमित चूहा भ्रूणीय तना कोशिका स्व-नवीकरण. कक्ष प्रतिनिधि 2021;37(5):109949. डोई:10.1016/j.celrep.2021.109949 (आईएफ:9.423)
[9] लिन क्यू,ये एक्स,यांग बी, एट अल. रियल टाइम प्रतिदीप्ति लूप-मध्यस्थ इज़ोटेर्माल प्रवर्धितव्यावहारिक परख के लिए तेज़ और संवेदनशील का पता लगाने स्ट्रेप्टोकोकस का गैलोलिटिकस उपप्रजाति गैलोलिटआईकस के साथ जुड़े कोलोरेक्टल कैंसर[जे].
विश्लेषणात्मक और जैवविश्लेषणात्मक रसायन शास्त्र, 2019, 411(26): 6877-6887.（आईएफ6.35）
[10] लिन क्यू,ये एक्स, हुआंग जेड, एट अल. ग्राफीन ऑक्साइड आधारित दमन का अविशिष्टता में लूप-मध्यस्थ आइसोथर कुप्रवर्धन संवेदनशील को सक्षम करना खोज साइक्लोऑक्सीजिनेज-2 एमआरएनए में रंगसीटीएएल कैंसर[जे]. विश्लेषण काल रसायन विज्ञान, 2019.（IF6.35）
उद्धरण:
[1] लोएब एल.ए., जूनियर आर. डी.एन.ए. पॉलीमरेज़ और मानव रोग[जे]। नेचर रिव्यू जेनेटिक्स।