NGS एडाप्टर, अगली पीढ़ी की अनुक्रमण लाइब्रेरी का एक अनिवार्य हिस्सा है, जो परीक्षण किए गए DNA खंड और फ्लो सेल (अनुक्रमण चिप) को जोड़ने में एक भूमिका निभाता है। लाइब्रेरी की गुणवत्ता और उपज निर्धारित करने में जोड़ की दक्षता एक महत्वपूर्ण कारक है। तो NGS एडाप्टर क्या है? NGS एडाप्टर के सामान्य प्रकार क्या हैं? और अपने अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म के लिए सही NGS एडाप्टर कैसे चुनें?

1. एनजीएस एडाप्टर क्या है?

2. एनजीएस सूचकांक चुनते समय आपको किन कारकों पर विचार करना चाहिए?

3. सूचकांक के सामान्य प्रकार क्या हैं?

4. एनजीएस एडाप्टर के सामान्य प्रकार क्या हैं?

• यूएमआई एडाप्टर
• पूर्ण एडाप्टर
• अपूर्ण एडाप्टर
• Tn5 एडाप्टर

5. अपने अनुक्रमण प्लेटफार्मों के लिए सही एनजीएस एडाप्टर कैसे चुनें?

6. पढ़ने के संबंध में

1. एनजीएस एडाप्टर क्या है?

एनजीएस एडाप्टर, अनुक्रमण में एडाप्टरों की एक श्रृंखला, एक ज्ञात अनुक्रम के साथ एक छोटा न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम है। यह लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड खंड के दोनों सिरों से जुड़ा हुआ है। अनुक्रमण के दौरान, यह लाइब्रेरी को चिप में संयोजित करने के लिए फ्लो सेल पर ज्ञात अनुक्रम के साथ संकरण करके अनुक्रमण शुरू करता है। तो एनजीएस एडाप्टर की संरचना क्या है?

इल्लुमिना प्लेटफॉर्म को उदाहरण के रूप में लेते हुए, एक एनजीएस एडाप्टर को तीन भागों में विभाजित किया जा सकता है:

पी5 और पी7: अनुक्रम को पी5 और पी7 सिरों के साथ फ्लो सेल पर संयोजित करके अनुक्रमण चिप पर लाइब्रेरी को स्थिर किया जाता है, जिससे ब्रिज-पीसीआर के माध्यम से क्लस्टर प्रतिक्रिया को सुविधाजनक बनाया जाता है।

Rd1 SP और Rd2 SP (Read1/Read2 अनुक्रमण प्राइमर): अनुक्रमण प्राइमरों के बंधन क्षेत्र, वह स्थिति इंगित करते हैं जहां अनुक्रम को पढ़ना शुरू किया जाता है।

सूचकांक (जिसे बारकोड के रूप में भी जाना जाता है): एक ज्ञात सिंथेटिक अनुक्रम जो मिश्रित लाइब्रेरी के अनुक्रमण में विभिन्न नमूनों को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है।

अंजीर। 1 इल्युमिना प्लेटफ़ॉर्म एकल इंडेक्स लाइब्रेरी

अंजीर। 2 एमजीआई प्लेटफॉर्म सिंगल-एंड इंडेक्स लाइब्रेरी

अनुक्रमण थ्रूपुट में वृद्धि के साथ, एक ही समय में कई नमूनों का अनुक्रमण किया जा सकता है। इसलिए विविध नमूनों में अंतर कैसे किया जाए, यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, NGS एडाप्टर के इंडेक्स अनुक्रमों का उपयोग अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) में विभिन्न नमूनों में अंतर करने के लिए किया जाता है। इंडेक्स चुनते समय आपको किन कारकों पर विचार करना चाहिए? कृपया पढ़ना जारी रखें...

2. सूचकांक चुनते समय आपको किन कारकों पर विचार करना चाहिए?

सूचकांक आम तौर पर 6nt-18nt की लंबाई पर होता है और सूचकांकों की संख्या के अनुसार एकल सूचकांक और दोहरे सूचकांक में विभाजित होता है। दोहरा सूचकांक परीक्षण किए जाने वाले टुकड़े के दोनों सिरों पर स्थित होता है। सूचकांक संयोजन का चयन करते समय आधार संतुलन और प्रतिदीप्ति संतुलन पर विचार किया जाना चाहिए।

आधार संतुलन का तात्पर्य एकल सूचकांक में आधार संतुलन के बजाय कई सूचकांकों के बीच संतुलन से है। इसे आधार प्रकार और आधार वितरण दोनों से विचार करने की आवश्यकता है। संयोजन का सिद्धांत यह है कि सूचकांकों के एक ही समूह में चार आधारों A/T/C/G को शामिल करने की आवश्यकता है, और इन चार आधारों का अनुपात करीब है, क्रमशः लगभग 25% के लिए लेखांकन।

फ्लोरोसेंस सिग्नल संतुलन फ्लोरोसेंट सिग्नल के संतुलन को सुनिश्चित करने के विकल्प को संदर्भित करता है जब आधार संतुलन की गारंटी नहीं दी जा सकती है। इल्लुमिना प्लेटफ़ॉर्म में 4-चैनल सीक्वेंसर में, dG/dT को हरे रंग के फ्लोरोसेंस के साथ लेबल किया जाता है, और dC/dA को लाल फ्लोरोसेंस के साथ लेबल किया जाता है। अनुक्रमण के दौरान, सफल अनुक्रमण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक चक्र में हरे और लाल दोनों प्रतिदीप्ति संकेत मौजूद होने चाहिए। इसलिए, सूचकांक का चयन करते समय हरे सिग्नल और लाल सिग्नल के बीच संतुलन पर विचार किया जाना चाहिए।

3. सूचकांक के सामान्य प्रकार क्या हैं?

सामान्य दोहरे सूचकांकों में आमतौर पर विशिष्ट दोहरे सूचकांक (यूडीआई), विशिष्ट दोहरे बारकोड (यूडीबी) और संयुक्त दोहरे सूचकांक (सीडीआई) शामिल होते हैं, जो सूचकांक होपिंग और गलत असाइनमेंट को काफी हद तक कम करते हैं।

यूडीआई और यूडीबी: दोनों सिरों पर सूचकांक एक-से-एक संगत हैं, समूहों में डिज़ाइन किए गए हैं, और दोनों सिरों पर क्रॉस-सत्यापित किए जा सकते हैं;

इल्युमिना के लिए स्टब्बी यूडीआई प्राइमर किट येसेन द्वारा आपूर्ति की गई (कैट#12404ES/12405ES)>>

सीडीआई: दोनों सिरों पर स्थित इंडेक्स को कुछ आवश्यकताओं के अनुसार संयोजित करके डबल-एंडेड इंडेक्स लाइब्रेरी बनाई जा सकती है;

इल्युमिना के लिए 384 सीडीआई प्राइमर, सेट 1-सेट 2 येसेन द्वारा आपूर्ति की गई (कैट #12412ईएस/12413ईएस)>>

थ्रूपुट और प्रवर्धन दक्षता में सुधार करने और अनुक्रमण लागत को कम करने के लिए, इल्युमिना ने नोवासेक और अन्य उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमकों के लिए ऐरे फ्लो सेल (पीएफसीटी) और विशिष्ट प्रवर्धन (एक्सएम्प) क्लस्टरिंग प्रौद्योगिकी की शुरुआत की, लेकिन अनजाने में नमूना लेबल बेमेल घटना और इंडेक्स होपिंग को बढ़ा दिया।

चित्र 3 इल्युमिना के विभिन्न उपकरण मॉडल गैर-पैटर्न वाले प्रवाह सेल या पैटर्न वाले प्रवाह सेल को अपनाते हैं

HiSeq3000/4000, HiSeq X Series और NovaSeq जैसे अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म द्वारा उजागर की गई इंडेक्स हूपिंग समस्या को दूर करने के लिए, Illumina ने लाइब्रेरी के दोनों सिरों पर इंडेक्स लगाने की रणनीति प्रस्तावित की, जो द्विपक्षीय सत्यापन कर सकती है और बेमेल एडेप्टर को समाप्त कर सकती है। दोनों सिरों पर अद्वितीय इंडेक्स का उपयोग करते समय, इंडेक्स त्रुटि आवंटन दर 0.01% तक कम हो जाएगी। पिछले पारंपरिक इंडेक्स क्रमचय समूह संयोजन विधि की तुलना में, इंडेक्स हॉपिंग को परिमाण के दो क्रमों से कम किया जाएगा।

पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी के निर्माण में, एक सिंगल-एंड इंडेक्स एडाप्टर उपलब्ध है। लेबल बेमेल मुख्य रूप से अनुक्रमण त्रुटियों के कारण होता है। कुल मिलाकर, लेबल बेमेल दर कम है (औसत 0.0004%, 0.001% तक)। हालाँकि, लक्षित कैप्चर लाइब्रेरी के निर्माण में, क्रॉसटॉक समस्या बढ़ जाती है क्योंकि कई चरणों से लेबल बेमेल हो जाएगा और आमतौर पर UDI/UDB/CDI एडाप्टर का उपयोग किया जाता है।

4.एनजीएस एडाप्टर के सामान्य प्रकार क्या हैं?

अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के विकास के साथ, अधिक से अधिक प्रकार के एडाप्टर हैं, जैसे कि सिंगल इंडेक्स/डबल इंडेक्स एडाप्टर (जैसा कि अनुभाग 3 में उल्लेख किया गया है), यूएमआई एडाप्टर, ट्रांसपोज़ेज़ एडाप्टर, पूर्ण/अपूर्ण एडाप्टर, आदि, जो विभिन्न अनुप्रयोग परिदृश्यों के लिए उपयुक्त हैं। यह भाग आपको एडाप्टर चयन की नींव देने के लिए इन एडाप्टरों को व्यवस्थित रूप से छांटता है।

4.1 यूएमआई एडाप्टर

अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMI) एडाप्टर कम आवृत्ति उत्परिवर्तन का पता लगाने और पूर्ण मात्रा निर्धारण के लिए एक अत्याधुनिक उपकरण है। UMI एक ज्ञात अनुक्रम के साथ एक यादृच्छिक सिंथेटिक अनुक्रम है। इसे पूरी तरह से यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड श्रृंखला, आंशिक पतित न्यूक्लियोटाइड श्रृंखला या निश्चित न्यूक्लियोटाइड श्रृंखला के रूप में डिज़ाइन किया जा सकता है।लंबाई आम तौर पर 10 एनटी (सिंगल-एंडेड यूएमआई) या 5-8 एनटी (डबल-एंडेड यूएमआई) होती है। इसका कार्य प्रवर्धन से पहले डीएनए टुकड़ों की स्थिति को स्थिर करना है, और प्रत्येक डीएनए अणु एक यूएमआई से मेल खाता है। इसलिए, जैव सूचना विज्ञान के विश्लेषण के दौरान, यह विभिन्न स्रोतों से डीएनए टेम्पलेट्स को अलग कर सकता है, पीसीआर प्रवर्धन और अनुक्रमण की प्रक्रिया में यादृच्छिक त्रुटियों के कारण होने वाले झूठे-सकारात्मक उत्परिवर्तनों को अलग कर सकता है, और जो वास्तव में रोगियों द्वारा किए जाते हैं, ताकि पृष्ठभूमि शोर को फ़िल्टर किया जा सके, कम आवृत्ति और बेहद कम आवृत्ति उत्परिवर्तन का सटीक पता लगाया जा सके और विभिन्न डीएनए अणुओं का पूर्ण परिमाणीकरण किया जा सके। इसका उपयोग कम आवृत्ति उत्परिवर्तन का पता लगाने में व्यापक रूप से किया जाता है, खासकर ट्यूमर अनुसंधान के क्षेत्र में।

चित्र 4 UMI एडाप्टर का योजनाबद्ध आरेख इल्लुमिना मंच की संरचना

4.2 पूर्ण एडाप्टर

पूर्ण एडाप्टर, पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी के लिए एक आवश्यक उत्पाद है, जिसमें अनुक्रमण के लिए आवश्यक सभी अनुक्रम होते हैं, जैसे कि इल्युमिना प्लेटफ़ॉर्म में P5, P7, RdS1, और RdS2, अनुक्रमण के लिए आवश्यकताओं के अनुसार अनुक्रम और UMI अनुक्रम भी अनुक्रमित करते हैं। पूर्ण एडाप्टर के साथ, इसे पीसीआर के माध्यम से अन्य एडाप्टर को पेश किए बिना सीधे अनुक्रमित किया जा सकता है। इसलिए, पूर्ण एडाप्टर का उपयोग पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी बनाने के लिए किया जा सकता है। पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी पीसीआर प्रवर्धन पूर्वाग्रह, त्रुटि दर और अनुक्रम दोहराव को कम कर सकती है, कुछ उच्च जीसी या उच्च एटी क्षेत्रों की कवरेज को बढ़ा सकती है जो जनसंख्या जीनोम अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं।

येसेन द्वारा आपूर्ति की गई इल्युमिना प्लेटफॉर्म के लिए एक पूर्ण एडाप्टर उत्पाद (कैट#13519ES/13520ES)>>

एमजीआई प्लेटफॉर्म के लिए एक पूर्ण एडाप्टर उत्पाद, जो येसेन द्वारा आपूर्ति किया गया है (कैट#13360ES/13361ES)>>

चित्र 5 पूर्ण एडाप्टर आरेख

4.3 अपूर्ण एडाप्टर

अधूरे एडाप्टर को एडाप्टर लिगेशन के बाद पीसीआर द्वारा अन्य अनुक्रमों को पेश करने की आवश्यकता होती है ताकि एक पूर्ण एडाप्टर बनाया जा सके। वे उच्च कनेक्शन दक्षता और उच्च प्रभावी लाइब्रेरी दर की विशेषता रखते हैं। पीसीआर प्रक्रिया प्रभावी लाइब्रेरी की सांद्रता सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण लाइब्रेरी के लिए एक संवर्धन प्रभाव है, और डबल-एंडेड इंडेक्स और यूएमआई अनुक्रम भी पेश कर सकती है।

4.4 Tn5 एडाप्टर

Tn5 एडाप्टर एडाप्टर अनुक्रम के भाग को Tn5 की प्रतिबंधात्मक एंडोन्यूक्लिएज गतिविधि के माध्यम से डीएनए टुकड़ों के दोनों सिरों से जोड़ते हैं। वे समय और नमूनों को बचाने के लिए विखंडन और एडाप्टर बंधन को एक साथ करते हैं। अंत में, लिंकर अनुक्रम, इंडेक्स, यूएमआई और अन्य अनुक्रमों के शेष भाग को पीसीआर द्वारा एक पूर्ण लाइब्रेरी बनाने के लिए पेश किया जाता है। इसका उपयोग कट और टैग लाइब्रेरी बनाने के लिए किया जा सकता है।

चित्र 6 Tn5 एडाप्टर लाइब्रेरी निर्माण का योजनाबद्ध आरेख

5. अपने अनुक्रमण प्लेटफार्मों के लिए सही एनजीएस एडाप्टर कैसे चुनें?

वर्तमान में, दो मुख्यधारा अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म हैं, जिनमें इल्युमिना और MGI शामिल हैं। NGS प्रदाता के लिए एक पूर्ण समाधान, येसेन ने इल्युमिना या MGI प्लेटफ़ॉर्म के लिए उपयुक्त कई NGS एडेप्टर विकसित किए हैं।

इल्युमिना प्लैटफ़ॉर्म के संदर्भ में, येसेन द्वारा आपूर्ति किए गए इल्युमिना एनजीएस एडाप्टर में तीन प्रकार शामिल हैं, जिसमें यूडीआई, सीडीआई और एक एकल इंडेक्स शामिल है। एमजीआई प्लैटफ़ॉर्म के संदर्भ में, येसेन द्वारा पेश किए गए एमजीआई एनजीएस एडाप्टर में दो प्रकार शामिल हैं, जिसमें डुअल शामिल है यूएमआई-यूडीबी और एकल सूचकांक.हमने निम्नलिखित तालिका में उत्पाद संबंधी जानकारी सूचीबद्ध की है, जिसमें क्रमशः एडाप्टर के प्रकार, उपलब्ध आकार, तथा एडाप्टर और प्राइमर की सांद्रता शामिल है।

पूर्ण और यूडीआई एनजीएस एडाप्टर को युग्मन समस्याओं के बारे में चिंता करने की आवश्यकता नहीं है, यह उन ग्राहकों के लिए उपयुक्त है जो उपयोग में आसान चाहते हैं; सीडीआई एनजीएस एडाप्टर में कम ट्यूब और छोटे आकार होते हैं, जो उन ग्राहकों के लिए उपयुक्त है जो आसानी से स्टोर और ले जाना चाहते हैं। पीसीआर-फ्री के लिए पूर्ण एनजीएस एडाप्टर के उपयोग की आवश्यकता होती है।

इल्लुमिना के लिए

इनट्यूब	हिएफ़ एनजीएस® डीएनए लिब प्रेप 384 सीडीआई प्राइमर इल्युमिना के लिए, सेट 1 (8*12, 96 इंडेक्स)	12412ईएस
	हिएफ़ एनजीएस® डीएनए लिब प्रेप 384 सीडीआई प्राइमर इल्युमिना के लिए, सेट 2 (8*12, 96 इंडेक्स)	12413ईएस
	Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI प्राइमर इल्युमिना के लिए, सेट 1 (96 इंडेक्स)	12414ईएस
	Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI प्राइमर इल्युमिना के लिए, सेट 1 (96 इंडेक्स)	12415ईएस
प्लेट में	Hieff NGS® स्टब्बी UDI प्राइमर किट इल्युमिना के लिए (1-384 इंडेक्स) सेट 1-4	12407ईएस
	इल्युमिना के लिए Hieff NGS® स्टब्बी UDI प्राइमर किट सेट1（96 वेल प्लेट,1-96 इंडेक्स） सेट 1	12327ईएस
	इल्युमिना के लिए Hieff NGS® स्टब्बी UDI प्राइमर किट सेट2（96 वेल प्लेट, 97-192 सूचकांक） सेट 2	12328ईएस
	इल्युमिना के लिए Hieff NGS® स्टब्बी UDI प्राइमर किट सेट3（96 वेल प्लेट,193-288 सूचकांक） सेट 3	12329ईएस
	इल्युमिना के लिए Hieff NGS® स्टब्बी UDI प्राइमर किट सेट4（96 वेल प्लेट, 289-384 इंडेक्स） सेट 4	12330ईएस

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