La Deossiribonucleasi I (DNasi I) è un'endonucleasi, la sua applicazione non è solo per mantenere l'integrità dell'RNA ma anche per l'analisi dell'impronta del DNA, la generazione di librerie di DNA casuali, la riduzione dell'appiccicosità nei lisati cellulari o negli estratti proteici, ecc. In una parola, la DNasi I può essere utilizzata in quasi tutte le applicazioni che richiedono scissioni enzimatiche del DNA. Quella che segue è un'introduzione dettagliata alla DNasi I e alla sua applicazione specifica.

1. Che cos'è la DNasi I?
2. DNasi I per la preparazione dell'estrazione di RNA senza DNA
3. DNasi I per la trascrizione in vitro per rimuovere il DNA stampo
4. DNasi I per la rimozione dell'rRNA
5. DNasi I per l'etichettatura del DNA
6. Altre applicazioni
7. Guida alla selezione del prodotto DNasi I

1. Che cos'è la DNasi I?

Desossiribonucleasi I (DNasi I) è un'endonucleasi non specifica che può digerire DNA a singolo o doppio filamento, presente in diversi tessuti e fluidi corporei. Può idrolizzare legami fosfodiesterici per produrre mono- e oligodesossinucleotidi contenenti un gruppo 5'-fosfato e un gruppo 3'-OH. L'intervallo di pH di lavoro ottimale della DNasi I è 7-8, la sua attività dipende da Ca2+ e può essere attivata da ioni metallici bivalenti come Mn2+, Mg2+, Zn2+, ecc. In presenza di Mg2+, la DNasi I taglia casualmente qualsiasi sito di DNA a doppio filamento; in presenza di Mn2+, la DNasi I può tagliare il DNA a doppio filamento nello stesso sito per formare un'estremità smussata o una sporgenza di estremità appiccicose di 1-2 nucleotidi.

Figura 1. Diagramma schematico della scissione del dsDNA da parte della DNasi I in presenza di Mg2+ e Mn2+.

Sebbene le scissioni della DNasi I siano generalmente considerate scissioni non specifiche, è più probabile che la DNasi I agisca su determinati frammenti di sequenza, come la regione del solco minore, ed è più incline alle scissioni di sequenze purina-pirimidina. Tuttavia, quando la DNasi I agisce su dsDNA eterogeneo, tutte e quattro le basi saranno scisse e l'effetto su una base specifica non sarà più di 3 volte maggiore di quello di altre basi.

2. DNasi I per la preparazione dell'estrazione di RNA senza DNA

Negli esperimenti biologici, il primo passo è preparare l'acido nucleico per studiare le varie funzioni dell'RNA. Tuttavia, poiché DNA e RNA vengono spesso rilasciati insieme durante il processo di lisi cellulare, l'interferenza tra i due non può essere evitata indipendentemente dalla soluzione di estrazione utilizzata, quindi è necessario utilizzare enzimi specifici per rimuovere l'interferenza. Per un'estrazione di RNA di alta qualità, la DNasi I viene utilizzata per rimuovere il DNA residuo dal campione.

La DNasi I può degradare il DNA a doppio e singolo filamento in oligonucleotidi e singoli nucleotidi, e il DNA nel prodotto di preparazione dell'RNA può essere efficacemente degradato. La DNasi I viene quindi inattivata riscaldando con un tampone di arresto. Durante il processo di riscaldamento, la struttura a forcina della molecola di RNA può essere aperta, il che facilita l'ingresso diretto dell'RNA nel processo di trascrizione inversa.
La qualità dell'RNA influenzerà direttamente i dati sperimentali in larga misura. In generale, i residui di gDNA non possono essere completamente evitati durante l'estrazione dell'RNA, pertanto, si raccomanda generalmente di trattare i campioni di RNA con DNasi I per digerire il gDNA residuo prima di affrontare applicazioni downstream impegnative (ad esempio analisi dell'espressione di mRNA, analisi del trascrittoma, ecc.). La fase di digestione del gDNA può essere eseguita durante l'estrazione dell'RNA, dopo l'estrazione dell'RNA o prima della trascrizione inversa dell'RNA.In base al posizionamento del prodotto, i prodotti forniti da Yeasen sono i seguenti:

Tabella 1: Elenco dei prodotti correlati alla rimozione del DNA dall'estrazione dell'RNA o prima della trascrizione inversa

3. DNasi I per la trascrizione in vitro per rimuovere il DNA stampo

La trascrizione in vitro (IVT) utilizza principalmente il DNA come stampo, più substrati e tamponi corrispondenti per ottenere RNA tramite trascrizione in vitro. Negli esperimenti di trascrizione in vitro, le RNA polimerasi come T7, T3 e SP6 sono comunemente utilizzate per la sintesi di RNA. L'RNA sintetizzato può avere residui di DNA. L'eliminazione dei residui di DNA è vantaggiosa per lo sviluppo di esperimenti a valle. Ad esempio, nella fase di sviluppo del vaccino mRNA, la rimozione dei residui è un passaggio fondamentale, che può ridurre la difficoltà della purificazione a valle e aumentare la purezza del prodotto. Il modello di DNA viene in genere rimosso utilizzando DNasi I ricombinante (RNasi-free).Secondo il processo di sintesi dell'mRNA, i prodotti forniti da Yeasen sono i seguenti: