Quali enzimi usano gli scienziati per legare un nuovo gene? Inutile dire che è inclusa la DNA ligasi. Quindi perché la DNA ligasi è così importante nel DNA ricombinante? Perché la DNA ligasi è responsabile della legatura del frammento bersaglio al vettore, che è uno degli elementi chiave che determinano il successo dell'esperimento. Come tipo di DNA ligasi, che ruolo svolge la DNA ligasi T4 negli esperimenti di clonazione molecolare? Come funziona? La DNA ligasi T4 verrà introdotta approfonditamente in seguito.

1. Che cos'è la T4 DNA ligasi?
2. Qual è la funzione della DNA ligasi T4?
3. La DNA ligasi T4 di Yeasen Biotech può essere utilizzata per la legatura dell'adattatore NGS
4. Una guida alla selezione per la DNA ligasi T4 di Yeasen Biotech

1. Che cos'è la T4 DNA ligasi?

La DNA ligasi T4 è una ligasi ATP-dipendente che catalizza la reazione di legatura tra molecole di DNA. Forma principalmente fosfodiestere collegando le estremità 3'-idrossile e 5'-fosfato. Le DNA ligasi sono coinvolte nei processi di replicazione e riparazione del DNA in tutti gli organismi. La DNA ligasi T4 codificata dal fago viene prodotta durante l'infezione da parte del fago T4 di E. coli.
Le ligasi utilizzate nell'ingegneria genetica sono principalmente la DNA ligasi di E. coli e la DNA ligasi T4, quest'ultima attualmente più ampiamente utilizzata. La DNA ligasi T4 può riparare i tagli a singolo filamento su DNA a doppio filamento, RNA a doppio filamento o filamenti ibridi DNA/RNA per collegare due nucleotidi adiacenti e svolge un ruolo importante nella riparazione e ricombinazione del DNA.
Nel processo di costruzione del plasmide ricombinante, la DNA ligasi T4 può essere utilizzata insieme agli enzimi di restrizione per completare l'esperimento di costruzione del plasmide ricombinante. Può catalizzare la formazione di un legame fosfodiesterico tra l'estremità 5'-P e l'estremità 3'-OH del DNA a doppio filamento e ha una buona efficienza di connessione per la connessione dell'estremità appiccicosa e la connessione dell'estremità smussata.

Figura 1. Meccanismo della ligasi del DNA T4

2. Qual è la funzione della DNA ligasi T4?

2.1 Costruzione vettoriale

Negli esperimenti di costruzione di vettori, diversi enzimi di restrizione possono produrre diversi tipi di estremità. Per estremità diverse, la DNA ligasi T4 avrà diverse strategie di legatura.

2.1.1 Clonazione con enzimi di restrizione, estremità appiccicose prodotte da una singola digestione

Durante la costruzione del vettore, se la stessa endonucleasi di restrizione viene utilizzata per tagliare il frammento di DNA del gene target e la molecola del vettore può produrre la stessa estremità appiccicosa, la DNA ligasi T4 può eseguire direttamente la connessione di ricombinazione. Tuttavia, poiché le estremità appiccicose sono le stesse, il gene target può essere inserito nel vettore nella direzione in avanti o inversa, il che aumenterà facilmente il carico di lavoro dello screening per i cloni ricombinanti corretti. Si consideri l'utilizzo del metodo di digestione a doppio enzima per la costruzione del vettore.
Inoltre, le estremità coesive del vettore preparato mediante digestione enzimatica singola possono anche essere accoppiate, e quindi si formano legami fosfodiesterici tra i nucleotidi sotto l'azione della T4 DNA ligasi, con conseguente auto-legatura del vettore. L'uso della fosfatasi alcalina per trattare il vettore digerito può rimuovere il gruppo fosfato all'estremità 5' del vettore in modo che il vettore non possa completare l'auto-legatura. Pertanto, sotto l'azione della T4 DNA ligasi, il vettore e il frammento bersaglio sono collegati per completare la costruzione del vettore ricombinante.

2.1.2 Clonazione con enzimi di restrizione, estremità appiccicose prodotte da doppie digestioni

Nel processo di costruzione del vettore, se due enzimi di restrizione con estremità adesive diverse vengono utilizzati per digerire rispettivamente il frammento target e il vettore, possono essere generate due estremità adesive diverse. A questo punto, la DNA ligasi T4 può legare selettivamente le stesse estremità adesive per garantire che il frammento target venga inserito nel vettore nella direzione corretta. Quando il frammento target e il vettore nella Figura 2 vengono digeriti con EcoR I e BamH I allo stesso tempo, le stesse estremità adesive possono essere collegate. C'è solo una direzione di legatura tra il frammento target e il vettore.

Figura 2. Legatura dell'estremità appiccicosa generata dalla digestione a doppio enzima^[1]

2.1.3 Clonazione di frammenti di restrizione, estremità smussata

Alcune endonucleasi di restrizione possono anche generare estremità smussate durante le scissioni enzimatiche, come Sma I e altre. La DNA ligasi T4 può formare direttamente un legame fosfodiesterico tra il vettore e l'inserto e non c'è bisogno di appaiamento tra le basi. Tuttavia, questo metodo ha una bassa efficienza di legatura ed è incline all'autolegatura del vettore. In genere, le estremità smussate possono essere convertite in estremità appiccicose e quindi legate. Ad esempio, aggiungendo basi complementari poli A e poli T alle estremità del frammento target e del vettore e rispettivamente estremità complementari artificialmente appiccicose si migliora l'efficienza di connessione tramite la deossinucleotidil transferasi terminale.

2.1.4 Clonazione TA

Il vettore T utilizzato nella clonazione TA ha una sporgenza T all'estremità 3'. Quando la sequenza di DNA del frammento target non è chiara, il frammento del gene target può essere collegato al vettore T tramite clonazione TA e il gene target può essere determinato tramite sequenziamento. La Taq DNA polimerasi utilizzata nella PCR ha attività di transferasi terminale e può aggiungere un nucleotide "A" all'estremità 3' del frammento di DNA. La T4 DNA ligasi può collegare direttamente il prodotto amplificato dalla Taq DNA polimerasi al vettore T e il prodotto amplificato dalla PCR può raggiungere lo scopo di una clonazione efficiente senza aggiungere adattatori artificiali.

Figura 3. Il flusso di lavoro della clonazione TA^[2]

2.2 Legatura dell'adattatore NGS

Durante la costruzione della libreria di sequenziamento di nuova generazione, è necessario collegare l'adattatore artificiale al prodotto PCR prima che possa essere fissato sulla cella di flusso sul chip di sequenziamento per completare il sequenziamento. La costruzione della libreria di collegamento di legatura di clonazione TA è un mezzo tecnico molto comune e il suo principio è simile alla clonazione TA sopra menzionata. Dopo che il frammento di DNA da sequenziare è fosforilato all'estremità 5' e "A" è aggiunto all'estremità 3', è complementare e accoppiato all'adattatore con l'estremità adesiva "T". Il doppio filamento completo viene quindi formato e sequenziato dalla macchina.
Durante la legatura TA, diversi tipi di campione o la complessità della struttura del frammento di acido nucleico influenzeranno l'efficienza della legatura, quindi anche gli adattatori di diverse piattaforme avranno un impatto sul risultato finale della libreria.
Ad esempio, l'adattatore Bubble della piattaforma MGI ha una speciale struttura secondaria e richiede un'efficienza di legatura molto elevata per la DNA ligasi T4; la riduzione dell'efficienza di legatura influisce direttamente sull'output della libreria.

Figura 4. Processo generale di legatura dell'adattatore

3.La DNA ligasi T4 di Yeasen Biotech può essere utilizzata per la legatura dell'adattatore NGS

Yeasen Biotech ha sviluppato appositamente Ligasi del DNA T4 veloce per la legatura di frammenti di DNA e adattatori nel processo di costruzione della libreria NGS. L'enzima ha una capacità di legatura efficiente, non solo una velocità di connessione rapida ma anche compatibile con vari tipi di campioni, il che è più vantaggioso per la connessione di frammenti di acido nucleico con strutture complesse. Attualmente, è stato verificato tramite sequenziamento ad alto rendimento di un gran numero di clienti. Per la connessione di adattatori Bubble sulla piattaforma MGI, è possibile ottenere anche un'eccellente qualità di sequenziamento.

3.1 Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligasi con efficienza di legatura ultra elevata

Utilizzare la DNA ligasi Fast T4 di Yeasen Biotech per costruire librerie con diversi tipi di adattatori. Il campione è un mimetico di cfDNA da 170 bp e la libreria Agilent 2100 viene utilizzata per rilevare i risultati. ①Prodotto adattatore non connesso; ②Prodotto adattatore a estremità singola; ③Prodotto adattatore a estremità doppia; ④Adattatore residuo. Dai risultati, si può vedere che l'efficienza di legatura degli adattatori a estremità singola e doppia è molto elevata.

Figura 5. Diversi tipi di prodotti di legatura rilevati dall'Agilent 2100

3.2 Yeasen Biotech Fast T4 DNA ligasi con eccellente resa della libreria

Utilizzando la DNA ligasi Fast T4 per diversi tipi di costruzione di librerie, le rese delle librerie sono migliori rispetto ad altre DNA ligasi T4.

Tabella 1. Resa delle librerie di diversi tipi di campioni

4. Una guida alla selezione per la DNA ligasi T4 di Yeasen Biotech

Yeasen è un'azienda biotecnologica impegnata nella ricerca, sviluppo, produzione e vendita di tre principali reagenti biologici: molecole, proteine ​​e cellule. Oltre alla Fast T4 DNA ligase, Yeasen Biotech ha anche Nuova ligasi del DNA T4 E Ligasi rapida del DNA T4 tra cui scegliere. Puoi sceglierli in base alle applicazioni visualizzate nella seguente tabella:

Tabella 2: Prodotti correlati

Riferimenti

[1] W. Yuan. Ingegneria genetica[M]. Chemical Industry Press, 2019.
[2] Clark DP, Pazdernik NJ, Mcgehee M R. Clonazione di geni per la biologia sintetica - ScienceDirect[J]. Biologia molecolare (terza edizione), 2019:199-239.
[3] Tomkinson AE, Vijayakumar S, Pascal JM, et al. DNA Ligasi: struttura, meccanismo di reazione e funzione[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(2):687-699.
[4] Shuman S. DNA Ligases: Progressi e Prospettive[J]. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(26):17365-17369.