1. Come impedire la degradazione dell'RNA?

2. Cosa sono gli inibitori della RNasi?

3. Cosa fa l'inibitore della RNasi?

4. Quali sono le caratteristiche di un inibitore della RNasi murino?

5. Prodotti correlati e prestazioni

6. Prodotti correlati

7. Domande frequenti

1. Come impedire la degradazione dell'RNA?

La RNasi svolge un ruolo importante nel metabolismo degli acidi nucleici e può essere trovata in quasi tutti i tipi di procarioti ed eucarioti. La RNasi viene secreta nei fluidi corporei come lacrime, saliva e sudore per difendersi dall'invasione di microrganismi, ed è presente anche nei detriti della pelle. Tuttavia, la fonte principale di RNasi nella maggior parte degli ambienti sono i microrganismi, vale a dire batteri e funghi. La RNasi è estremamente difficile da inattivare e mostra elevata stabilità, resistenza al calore, resistenza agli acidi e resistenza agli alcali. Dopo la denaturazione termica, può riacquistare rapidamente la sua struttura originale. La RNasi è solitamente molto attiva ed è ampiamente distribuita sia nelle cellule e nei tessuti eucariotici che procariotici. L'RNA nel campione può degradarsi completamente con solo una traccia di contaminazione da RNasi. La contaminazione da RNasi negli studi può provenire sia da fonti interne che esterne. La RNasi nelle cellule è principalmente una fonte endogena di contaminazione, mentre le fonti esogene includono le forniture sperimentali, l'ambiente di laboratorio e gli sperimentatori stessi. Le RNasi, in particolare i membri della famiglia RNasi A, sono proteine ​​piccole e compatte contenenti pochi residui di cisteina in grado di formare molti legami disolfuro intramolecolari. Dopo essere tornate a temperatura ambiente, in assenza di un agente denaturante, le RNasi denaturate ripristineranno la loro struttura naturale e alcune funzioni. Pertanto, le RNasi mantengono un'attività considerevole dopo ripetuti cicli di congelamento-scongelamento, anche dopo l'autoclavaggio. La natura stabile di questi enzimi li rende resistenti a molti metodi di decontaminazione, che solitamente richiedono metodi chimici aggressivi per eliminare le RNasi da superfici e soluzioni.

Per evitare la degradazione dell'RNA vulnerabile, è necessario adottare speciali precauzioni quando si lavora con l'RNA. Per controllare l'RNasi esogena, l'operatore deve indossare guanti durante l'esperimento e cambiarli dopo aver toccato la pelle, le maniglie delle porte e la superficie di oggetti comuni. Inoltre, l'operatore deve utilizzare una speciale pistola per pipette per l'operazione di RNA e utilizzare punte da parete, provette da centrifuga, composti e reagenti privi di RNasi. Tenere lontano o coprire i fori di ventilazione e le finestre aperte e utilizzare aree meno frequentate come aree prive di RNasi. Durante l'estrazione e l'analisi dell'RNA, non eseguire altri esperimenti che potrebbero causare contaminazione da RNasi.
Il metodo per inibire l'attività della RNasi endogena consiste innanzitutto nel preservare il campione. Dopo che il tessuto è stato campionato, l'RNA non deve essere estratto direttamente. Invece, deve essere rapidamente congelato e conservato in un ambiente a -80°C con azoto liquido nel tempo, e l'esperimento deve essere eseguito il prima possibile per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA.Gli inibitori della RNasi vengono aggiunti al lisato cellulare per rompere le cellule e contemporaneamente inattivare la RNasi, riducendo al minimo l'attività della RNasi rilasciata durante la rottura cellulare. Tutti i reagenti e le attrezzature devono essere sottoposti a un trattamento speciale per inattivare le RNasi prima dell'uso.

Inoltre, gli inibitori dell'RNA possono essere utilizzati per inibire l'attività dell'RNasi e prevenire la degradazione dell'RNA da parte dell'RNasi. Esistono diversi tipi di inibitori dell'RNA:

• Dietil pirocarbonato (DEPC): è un inibitore forte ma non completo della RNasi. Denatura la proteina attraverso la combinazione dell'anello imidazolico dell'istidina nel gruppo genico attivo della RNasi, inibendo così l'attività dell'enzima.
• Isotiocianato di guanidina: attualmente considerato l'inibitore più efficace della RNasi, può anche inattivare la RNasi durante la lisi dei tessuti, il che può distruggere la struttura cellulare e dissociare l'acido nucleico dalla nucleoproteina, e ha anche un certo effetto sulla RNasi. Forte effetto denaturante.
• Complesso ribonucleosidico vanadilico: complesso formato da ioni ossido di vanadio e nucleosidi, che possono combinarsi con la RNasi per formare un analogo di transizione, inibendo quasi completamente l'attività della RNasi.
• Inibitore proteico della RNasi (RNasin): glicoproteina acida estratta dal fegato di ratto o dal blastodisco umano, la RNasin è un inibitore non competitivo della RNasi, che può legarsi a una varietà di RNasi, rendendola inattiva.
• Altri: SDS, urea, terra di diatomee, ecc. hanno anche un certo effetto inibitorio sulla RNasi.

2. Cosa sono gli inibitori della RNasi?

Gli inibitori della RNasi sono una classe di sostanze che possono inibire l'attività della RNasi. Gli inibitori comuni della RNasi includono il Dietil Pirocarbonato (DEPC), l'Isotiocianato di Guanidina, i Complessi Ribonucleosidici Vanadil (RVC) e gli inibitori proteici della RNasi (RNasin). Tra questi, il DEPC e l'isotiocianato di guanidina hanno una certa tossicità e l'RVC ha un effetto inibitorio sulla PCR polimerasi, che non favorisce gli esperimenti successivi. L'RNasin non è tossico ed è un inibitore non competitivo della RNasi, che può legarsi a varie RNasi per inattivarle.

3. Cosa fa l'inibitore della RNasi?

Gli inibitori della RNasi sono comunemente usati come misura precauzionale nelle manipolazioni enzimatiche dell'RNA per inibire e controllare tali contaminanti. La RNasi è una glicoproteina acida estratta dal fegato di ratto o dal blastoderma umano, che può legarsi specificamente alla RNasi in modo non covalente per formare un complesso, causando l'inattivazione della RNasi, proteggendo così l'integrità dell'RNA. Attualmente, l'inibitore della RNasi aiuta a prevenire la degradazione dell'RNA in applicazioni come la sintesi di cDNA, RT-PCR, reazioni di trascrizione/traduzione in vitro o purificazione dell'RNA.

4. Quali sono le caratteristiche di un inibitore della RNasi murino?

Gli inibitori RNasi murini ricombinanti non contengono 2 cisteine ​​sensibili all'ossidazione che sono contenute negli inibitori RNasi di origine umana. Pertanto, l'inibitore RNasi murino ha un'elevata attività antiossidante ed è più stabile per esperimenti a basso DTT. Inoltre, l'inibitore RNasi murino di Yeasen ha le seguenti caratteristiche:
1) Inibizione completa della RNasi: l'inibitore murino della RNasi YEASEN inibisce specificamente la RNasi A, la RNasi B, la RNasi C e così via.
2) Condizioni di reazione versatili: l'inibitore della RNasi è attivo a pH 5,0-9,0 e 25℃-55℃, condizioni adatte alla trascrittasi inversa termostabile.
3) Sono possibili più esperimenti a valle: non si osserva alcuna inibizione dell'attività della polimerasi quando l'inibitore RNasi viene utilizzato con Taq DNA polimerasi, AMV o M-MuLV Reverse Transcriptase o RNA polimerasi fagiche (SP6, T7 o T3).
4) Beni prodotti in serie: una capacità produttiva unitaria di 2 miliardi di U è utile per la gestione dei costi, in quanto garantisce l'omogeneità del prodotto, la stabilità della fornitura e la tempestività.
5) Coerenza da lotto a lotto: piattaforma di espressione e purificazione di proteine ​​mature tramite sistema di gestione della qualità ISO13485, test di controllo qualità secondo requisiti di qualità per garantire la stabilità del prodotto tra i lotti.

5. Prodotti correlati e prestazioni

A. L'inibitore della RNasi blocca l'attività della RNasi

1μg di RNA totale delle cellule HEK, 1μL di inibitore della RNasi può inibire efficacemente 5 ng di RNasi.

Figura 1. Effetto inibitorio dell'inibitore della RNasi murina.

B. L'inibitore della RNasi supera i prodotti stranieri nei test qPCR

L'impatto inibitorio degli inibitori della RNasi derivati ​​da topi (MRI) della Yeasen and R* Company è stato misurato utilizzando la tecnica qPCR in circostanze sperimentali identiche e l'inibitore della RNasi della fonte YEASEN Murine ha inibito in modo efficiente la RNasi A nel sistema. L'impatto dell'inibizione è stato superiore a quello dei concorrenti.

Figura 2. Test di inibizione della RNasi R* MRI

Nota: le curve nella figura da sinistra a destra sono: controllo positivo (solo RNA, senza RNasi e MRI), 40 U MRI, 30 U MRI, 20 U MRI, 10 U MRI e controllo negativo (RNA + RNasi, senza MRI).

Figura 3. Test di inibizione della RNasi Yeasen MRI

Nota: le curve nella figura da sinistra a destra sono: Controllo positivo (solo RNA, senza RNasi e MRI), 80 U MRI, 60 U MRI, 40 U MRI, 30 U MRI, 20 U MRI, 10 U MRI, Controllo negativo (RNA+RNasi, senza MRI).

Figura 4. La TC dei risultati RT-qPCR di Yeasen MRI e R* MRI

6. Prodotti correlati

I prodotti correlati che Yeasen può fornire sono mostrati nella Tabella 1:

Tabella 1.Elenco dei prodotti

7. Domande frequenti

D1: Ci sarà RNasi nell'inibitore murino della RNasi?
R: Ogni reagente rileverà l'attività della RNasi per garantire che l'inibitore della RNasi murina non determini contaminazione da RNasi.
D2: Gli inibitori della RNasi murina avranno un impatto sugli esperimenti PCR successivi?
R: Non avrà alcun effetto. Ogni lotto di inibitore della RNasi murina è privo di contaminazione genomica dopo i test di qualità e può essere utilizzato nella ricerca RT-PCR e RT-qPCR.
D3: L'inibitore della RNasi murina verrà inattivato?
R: Gli inibitori vengono inattivati ​​a temperature superiori a 65°C; anche un'agitazione vigorosa può causare l'inattivazione.
D4: Quali precauzioni si devono adottare quando si utilizza un inibitore della RNasi murina per preparare il sistema di reazione?
Risposta: Durante la preparazione del sistema, è possibile aggiungere prima un inibitore della RNasi e poi altri componenti che potrebbero introdurre fonti di contaminazione da RNasi.
D5: L'inibitore della RNasi murina ha attività endonucleasica ed esonucleasica?
Risposta: Non vi è alcuna attività endonucleasica ed esonucleasica, il che contribuisce a migliorare la resa del prodotto.

Per quanto riguarda la lettura:

Inibitori della RNasi murina ——Elimina con successo la contaminazione da RNasi e preserva l'RNA

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