Con il rapido sviluppo della biotecnologia, la terapia mRNA, come metodo di trattamento emergente, ha attirato molta attenzione grazie alla sua forte programmabilità e alla rapida velocità di risposta. Nei campi dei vaccini mRNA e della terapia genica, la sintesi efficiente di mRNA di alta qualità è un passaggio fondamentale per raggiungere gli obiettivi terapeutici. Durante questo processo, la T7 RNA polimerasi (T7 RNAP) svolge un ruolo essenziale, può catalizzare efficacemente la sintesi in vitro di mRNA.
Sebbene il T7 RNAP svolga un ruolo cruciale nella sintesi dell'mRNA, spesso produce RNA a doppio filamento (dsRNA) come sottoprodotto nella pratica. Il dsRNA è uno dei tratti distintivi di molti virus e pertanto è facilmente riconosciuto dalle proteine intracellulari leganti il dsRNA, innescando risposte immunitarie innate e reazioni infiammatorie. Ciò significa che se le formulazioni di mRNA contengono un livello più elevato di dsRNA, ciò potrebbe portare a un'attivazione immunitaria non necessaria, che potrebbe influire sull'efficacia terapeutica o causare gravi effetti collaterali. Un dsRNA eccessivo può anche interferire con la normale funzione dell'mRNA, inclusa l'efficienza della traduzione e la stabilità dell'mRNA, influenzando indirettamente l'efficacia della terapia a mRNA.
Figura 1: Impatto dei sottoprodotti dsRNA e della reazione T7 RNAP ottimizzata.
Pertanto, sviluppare e adottare metodi efficaci per ridurre la generazione di dsRNA è una parte cruciale dello sviluppo della tecnologia mRNA. I ricercatori hanno sviluppato varie strategie, tra cui l'uso di polimerasi RNA T7 migliorate, nucleotidi di modifica, ottimizzazione dei buffer di trascrizione IVT e processi di purificazione a valle. Yeasen Biology utilizza le capacità della sua piattaforma di evoluzione diretta ZymeEditor per evolvere continuamente la materia prima enzimatica principale per la sintesi in vitro di mRNA: la polimerasi RNA T7. Abbiamo sviluppato una RNA polimerasi T7 a basso contenuto di dsRNA che sopprime l'attività RDRP della RNA polimerasi T7, riducendo sostanzialmente la formazione di dsRNA e abbassando così in modo significativo il contenuto di dsRNA.
Dati del prodotto
Resa: oltre 9 mg/mL
Contenuto di dsRNA: il contenuto di dsRNA è stato ridotto significativamente di almeno 10 volte
Efficienza di tappatura: oltre il 99%
Bassa dsRNA T7 RNA polimerasi Processo di selezione:
1) la costruzione di una libreria casuale e del metodo di screening ad alto rendimento FADS, una libreria di mutazioni casuali di oltre 10^6 è stato proiettato.
2) sono stati utilizzati un design semi-razionale e la tecnologia delle micropiastre per esaminare una libreria satura di siti. Entrambi i metodi hanno prodotto mutanti della RNA polimerasi T7 a basso contenuto di dsRNA. Considerando il contenuto di dsRNA e assicurandosi che altri indicatori non siano ridotti (come integrità/efficienza di capping/resa, ecc.), sono stati selezionati diversi mutanti e uno denominato CleaScrip™ T7 è stato utilizzato per applicazioni commerciali.
Dati del prodotto
In diversi scenari applicativi di lunghezza, la RNA polimerasi T7 a basso contenuto di dsRNA ha mostrato una diminuzione altamente significativa rispetto ai prodotti WT T7 e della concorrenza, garantendo al contempo che resa e integrità non siano ridotte.
| Lunghezza del frammento | Polmone RNA T7 | Prodotto(mg/ml） |
Integrità(%） | Contenuto di dsRNA (ng di dsRNA prodotto per 1ug di RNA) |
| 4K | T7-peso | 12.4 | 88.3 | 0,4273 |
| Scrittura pulita™ Numero 7 | 12.1 | 89,9 | 0,0129 | |
| Azienda A | 11.0 | 87,8 | 0,0323 | |
| 9K | T7-peso | 9.5 | 81.9 | 2.9180 |
| Scrittura pulita™ Numero 7 | 9.0 | 82.0 | 0,0379 | |
| Azienda A | 7.2 | 78.7 | 0,1805 |
Utilizzando una concentrazione di cap di 2,5 mM, è ancora possibile ottenere un'eccellente efficienza di capping su diverse lunghezze di frammento rispetto a WT. Inoltre, si osservano anche prestazioni di espressione proteica superiori a livello cellulare.
| Ingresso analogico del cappuccio（mm） | Efficienza di limitazione (capping efficiency)%）4K | |
| Peso | Basso dsRNA | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
Il brevetto è stato depositato negli Stati Uniti.
Informazioni sul prodotto
| Nome del prodotto | Numero di catalogo | Specificazione | Volume |
| CancellareTM T7 RNA polimerasi (dsRNA basso, 250 U/μL) | 10628ES | 100/2500/25.000 KU | 400 μL/10 mL/100 mL |
| CancellareTM T7 RNA Polimerasi GMP-grade (basso dsRNA, 250 U/μL) | 10629ES | 100/2500/25.000 KU | 400 μL/10 mL/100 mL |