Il kit di sintesi dell'RNA T7 ad alto rendimento facilita la sintesi efficiente delle trascrizioni con lunghezze diverse

IL Ddescrizione del kit di sintesi di RNA ad alta resa T7

Il kit di sintesi dell'RNA ad alta resa T7 ottimizza il sistema di reazione di trascrizione. Il kit può sintetizzare l'RNA a singolo filamento in modo efficiente utilizzando la polimerasi dell'RNA T7, la lDNA a doppio filamento inearizzato con la sequenza del promotore T7 come stampo, NTP come substrati per trascrivere la sequenza di DNA a valle del promotore. Durante la trascrizione, i nucleotidi modificati possono Anche essere aggiunti come substrati per produrre biotina o RNA marcato con colorante.

Questo kit può sintetizzare Entrambi trascrizioni lunghe e trascrizioni corte, l'RNA può essere prodotto a 100-200 μg con 1 μg di input di stampo di DNA. L'RNA sintetizzato tramite trascrizione può essere utilizzato per varie applicazioni a valle, come la ricerca sulla struttura e la funzione dell'RNAHes, protezione RNasi, ibridazione della sonda, RNAi, microiniezione e traduzione in vitro.

Principio di sintesi

Figura 1: Processo di trascrizione dell'RNA in vitro

Vantaggi del prodotto

Alta resa: può produrre fino a 200 μg in 2 ore attraverso la reazione di trascrizione

Maggiore versatilità: adatto per la trascrizione di RNA da 20nt a 10000nt

Prestazioni eccellenti: ridurre efficacemente i sottoprodotti della trascrizione durante il processo IVT

Applicazioni multiple: può essere utilizzato per la sintesi di RNA ordinario, marcato e modificato

Proprietà del prodotto

Figura 2: Resa di trascrizioni di diverse lunghezze

Figura 3: Qualità delle trascrizioni di diversa lunghezza

Figura 4: Espressione di trascritto mRNA In HEK-293 cellule

Nota: l'mRNA è stato tappato con l'enzima Vaccinia Capping Enzyme (Yeasen#10614/10615).

Metodi sperimentali

Reagenti di scongelamento

    Centrifugare brevemente la miscela di RNA polimerasi T7 e posizionarla Esso su ghiaccio. Scongelare il tampone di trascrizione 10× e il ribonucleotideS (ATP, CTP, GTP, UTP), mescolare e centrifugare sul fondo della provetta, posizionare il tampone di trascrizione 10× a temperatura ambiente e disporre 4 tipi di ribonucleotidi su ghiaccio.

    B.Reazione di trascrizione dell'assemblaggio a temperatura ambiente

      Preparare il sistema di reazione secondo il seguente sistema:

      Componenti

      Volume (µL)

      Concentrazione finale

      H senza RNasi2Lo

      Fino a 20

      -

      10×tampone di trascrizione

      2

      1×

      CTP / GTP / ATP / UTP (100 mM ciascuno)

      2 ciascuno

      10 mM ciascuno

      Modello di DNA

      1 µg

      -

      Miscela di RNA polimerasi T7

      2

      -

      Note:

      1. La reazione è configurata a temperatura ambiente. Poiché il tampone di trascrizione 10× contiene spermidina, l'elevata concentrazione di spermidina può causare la precipitazione del modello di DNA a bassa temperatura.
        Per trascrizioni brevi (<100 nt), è possibile utilizzare un modello da 2 µg, estendendo il tempo di trascrizione a 4-8 ore.
        3. Per trascrizioni lunghe (>1000 nt), si raccomanda di utilizzare plasmidi linearizzati come modelli per la trascrizione.
        4. Eseguire la reazione nello strumento PCR con il coperchio caldo aperto per evitare l'evaporazione.
        5. Il prodotto di reazione può avere un precipitato bianco. Il precipitato è il pirofosfato di magnesio prodotto da gli ioni pirofosfato e magnesio liberi nella soluzione di reazione che non influenzano gli esperimenti successivi. Se si desidera rimuoverli, è possibile aggiungere un po' di EDTA. Se l'aggiunta di EDTA influenza gli esperimenti successivi, il surnatante può anche essere recuperato tramite centrifugazione.
        6. Conservare i reagenti e i contenitori senza contaminazione da RNasi.
      C. Incubare a 37°C per 2 ore

      Miscelare la soluzione dei componenti, centrifugare brevemente sul fondo della provetta e incubare a 37°C per 2 ore. Se la lunghezza del trascritto è inferiore a 100 nt, estendere il tempo di reazione a 4-8 ore.

      Trattamento con D.DNasi I (facoltativo)

      Una volta completata la reazione, aggiungere 2 μL di DNasi I (RNasi-free) a ciascuna provetta e incubare a 37°C per 15 minuti per rimuovere il DNA stampo.

      Domande frequenti

      1. Bassa resa di trascrizione

      La qualità del template è strettamente correlata alla resa. La resa del gruppo sperimentale è significativamente inferiore a quella del gruppo di controllo. Le possibili ragioni sono:

      • Il modello sperimentale contiene componenti inibitori;
      • Forse c'è qualcosa di sbagliato nel modello.

      Suggerimenti: ① Ri-purificare il modello; ② Determinare la quantificazione del modello e la sua integrità; ③ Estendere il tempo di reazione; ④ Aumentare la quantità di input del modello; ⑤ Utilizzare altri promotori e altre RNA polimerasi.

      1. Bassa resa delle trascrizioni brevi

      Brevi frammenti di template possono inibire la reazione. Quando il prodotto di trascrizione è inferiore a 100 nt, se si desidera aumentare la resa, estendere il tempo di reazione a 4-8 ore o aumentare la quantità di template a 2 μg.

      1. La lunghezza della trascrizione dell'RNA è più grande di quanto previsto

      Se il risultato dell'elettroforesi mostra che la banda del prodotto è più grande della dimensione prevista, le possibili ragioni potrebbero essere: ①Il modello del plasmide potrebbe non essere completamente linearizzato; ②L'estremità 3' del filamento senso ha una struttura prominente; ③L'RNA ha una struttura secondaria che non è completamente denaturata.

      Suggerimenti: ① Verificare se il modello è completamente linearizzato e, se necessario, eseguire un'ulteriore linearizzazione; ② Selezionare un enzima di restrizione adatto per evitare sporgenze 3' oppure utilizzare la DNA polimerasi Klenow Fragment/T4 per completare la trascrizione prima di procedere; ③ Utilizzare un gel denaturato per rilevare i prodotti dell'RNA.

      1. La lunghezza della trascrizione dell'RNA è più piccolo di quanto previsto

      Se l'elettroforesi mostra che la banda del prodotto è più piccola della dimensione prevista, le possibili ragioni sono: ①Il modello contiene una sequenza di terminazione simile al terminatore della RNA polimerasi T7; ②Il contenuto di GC di il modello è troppo alto.

      Suggerimenti: ①Abbassare la temperatura di reazione (ad esempio, 30°C). A volte abbassare la temperatura può contribuire ad estendere la lunghezza della trascrizione, ma potrebbe ridurre la resa. Provare altro RNA polimerasi per la trascrizione; ②Se il contenuto di GC nel modello è elevato, eseguire la reazione a 42℃ oppure aggiungere SSB per aumentare la resa e la lunghezza della trascrizione.

      1. Coda elettroforetica dei prodotti trascrizionali

      La coda durante l'elettroforesi può essere causata da: ① Contaminazione da RNasi durante l'operazione sperimentale; ②Il modello di DNA è contaminato da RNasi.

      Suggerimenti: ①Utilizzare puntali per pipette e provette EP privi di RNasi, indossare guanti e maschere in lattice monouso e tutti i reagenti sono preparati con H privo di RNasi.2O. ②Ripurificare il DNA stampo.

      Informazioni per l'ordinazione

      Nome del prodotto

      Numero di catalogo

      Sspecificazione

      Kit di sintesi di RNA ad alta resa T7

      10623ES

      50/100/500 dollari

      T7 RNA polimerasi di grado GMP (250 U/μL)

      10625ES

      10KU/100KU/2500KU/25MU

      Pirofosfatasi, inorganica di grado GMP (1 U/μL)

      10620ES

      10U/100U/1000U

      Inibitore della RNasi murina di grado GMP (40 U/μL)

      10621ES

      10KU/20KU/100KU/1MU

      Enzima di capping del vaccino mRNA di grado GMP

      10614ES

      2KU/10KU/100KU

      mRNA Cap 2'-O-metiltransferasi di grado GMP

      10612ES

      10KU/50KU/250KU

      Desossiribonucleasi I (DNasi I) di grado GMP

      10611ES

      500/2000/10000 unità

      Kit master per l'isolamento dell'mRNA Hieff NGS®

      12603ES

      24/96 t

      Indagine