Le perle magnetiche sono uno dei prodotti necessari nella costruzione di librerie di sequenziamento ad alto rendimento. Possono purificare DNA o RNA, selezionare frammenti di DNA di dimensioni target e arricchire acidi nucleici target. Con lo sviluppo della tecnologia di sequenziamento, sono emerse perle magnetiche specializzate in diversi campi di applicazione, tra cui perle magnetiche di purificazione del DNA, perle magnetiche di selezione delle dimensioni del DNA, perle magnetiche di purificazione dell'RNA e perle magnetiche di arricchimento dell'mRNA. Quindi quali sono i principi delle varie perle magnetiche? Come scegliere?

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1. Perle di DNA
2. Introduzione alle perle di DNA stellari
3. Perle di purificazione dell'RNA
4. Perle magnetiche arricchite di mRNA
5. Raccomandazione del prodotto perline magnetiche Yeasen

1. Il DNA Perline

1.1 Principi di base

Figura 1. Struttura della perla magnetica carbossilica

Figura 2. Principio di purificazione del DNA con sfere magnetiche

1.2 Processo operativo

Figura 3. Fasi di purificazione del DNA

Figura 4. Fasi di selezione delle dimensioni del DNA

1.3 Suggerimenti per l'utilizzo delle perline magnetiche

Resa migliorata e selezione accurata delle dimensioni

(1) Mescolare bene prima dell'uso ed equilibrare le perle magnetiche a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.

——La solubilità del PEG nelle sfere magnetiche il tampone è facilmente influenzato dal pH e dalla temperatura.Prima dell'uso è necessario equilibrare a temperatura ambiente per fare le perle magnetiche sono sospese uniformemente e il PEG è completamente disciolto per evitare di influenzare gli effetti di adsorbimento e separazione

(2) Il tempo di adsorbimento deve essere sufficiente e completamente miscelato per rendere adeguato l'adsorbimento;

(3) Lavaggio con etanolo all'80% durante la purificazione o la separazione;

——Sotto l'80% di etanolo, l'acido nucleico viene disidratato e raccolto strettamente, e non si dissolverà. Gli enzimi residui, i tamponi, le impurità, ecc. nel sistema vengono puliti con etanolo per ottenere un prodotto più puro. biblioteca.

(4) Durante la selezione delle dimensioni, confermare il volume del campione per garantire che il rapporto di aggiunta delle sfere magnetiche sia corretto;

——Durante la selezione delle dimensioni, è necessario immettere con precisione il volume corrispondente di sfere magnetiche, in modo che la proporzione sia accurata, poiché la variazione della concentrazione di PEG e ioni sale nel tampone può influenzare i risultati.

(5) Prima della fase di eluizione, lasciare che l'alcol si volatilizzi completamente, ma impedire alle perle di essiccazione eccessiva

——In genere, può essere essiccato in 2~3 minuti. Quando il numero di perline magnetiche è grande e difficile da essiccare, Si consiglia di operare in più provette da centrifuga.

(6) Se le sfere magnetiche sono agglomerate o lamellari, il tempo di eluizione può essere esteso dopo aver mescolato completamente;

——Potrebbe essere causato da impurità nel DNA o tempo di essiccazione troppo lungo. Generalmente, quando ci sono molte impurità nel DNA, si consiglia di purificarlo prima Prima selezione della taglia.

2. Introduzione alle perle di DNA stellari

2.1 Introduzione delle prestazioni di purificazione

• Sistema tampone unico: frammenti di DNA fino a È possibile recuperare 50 bp.
• Elevato tasso di recupero: ≥90%.
• Rimuove efficacemente le impurità: rimuove efficacemente impurità quali dimero di primer, dNTP, sale inorganico e proteine.
• Ampia gamma di applicazioni: adatto per la purificazione del DNA in scenari quali digestione enzimatica, legatura, clonazione e creazione di librerie NGS.

Tabella 1. Efficienza di purificazione e recupero del DNA di sfere magnetiche con diversi rapporti

Figura 5. Effetto di purificazione dei risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio con sfere magnetiche

M：scala del DNA da 1 kb;

2.2 Prestazioni di selezione delle dimensioni

• Facile A operare: il principio di separazione e il funzionamento sperimentale sono completamente coerenti con le sfere magnetiche XP
• Selezione accurata delle dimensioni: la dimensione dei frammenti ordinati è accurata e stabile
• Ampia applicabilità: adatto per edificio Librerie di DNA e RNA e adattamento per frammentare la selezione delle dimensioni di vari tipi di campione
• Prestazioni di costo ultra-elevate: qualità stabile, prezzo più economico, servizio pre-vendita e post-vendita più attento

Figura 6. Risultati della selezione delle dimensioni del DNA

3. Perle di purificazione dell'RNA

• Alta qualità: materie prime importate, qualità altamente stabile
• Sistema tampone ottimizzato: garantisce la purezza e l'integrità dell'RNA e previene efficacemente la degradazione dell'RNA
• Alta efficienza: recupero efficiente, adatto per la costruzione di librerie di RNA o in vitro recupero del prodotto di trascrizione, ecc.

Figura 7. Elettroforesi di diversi campioni dopo la purificazione

4. Perle magnetiche arricchite di mRNA

4.1 Principio di isolamento dell'mRNA

Figura 8.principio di arricchimento e purificazione delle perle magnetiche di mRNA

4.2 Prestazioni delle perle di isolamento dell'mRNA

• Elevata efficienza: la purificazione dell'mRNA può essere completata entro 45 minuti
• Elevata purezza: le sfere magnetiche oligo (dT) legano specificamente l'mRNA
• Affidabile: l'mRNA ottenuto è adatto per NGS, in vitro traduzione, RT-PCR e sintesi di cDNA

Figura 9. Kit di isolamento dell'mRNA per la purificazione dell'mRNA da diversi campioni di RNA

Nota: la resa genica housekeeping rappresenta l'effetto del recupero di mRNA. Resa genica correlata a rRNA caratterizzazione efficienza di rimozione dell'rRNA

4.3 Domande frequenti sulle palline magnetiche mRNA

(1) Perché le sfere magnetiche si agglomerano e come risolvere questo problema?

——Perline magnetiche l'agglomerazione ridurrà la resa e la purezza dell'mRNA. Il campione può contenere molte impurità, come polisaccaridi, proteine ​​e DNA a catena lunga. Queste impurità porteranno a perle magnetiche agglomerazione. La soluzione è quella di soffiare le perle magnetiche attraverso una pipetta. Il DNA genomico può essere rimosso mediante trattamento con DNasi prima della purificazione. Se la dimensione iniziale del campione è troppo grande e supera il carico delle sfere magnetiche, anche le sfere magnetiche si agglomereranno. Si consiglia di operare in base alla quantità di input nel manuale.

(2) Perché la resa di mRNA è bassa?

——Ci sono molte ragioni per la bassa resa di mRNA:

• Il livello di espressione dell'mRNA delle cellule o dei tessuti è basso, quindi possiamo selezionare i campioni del periodo di espressione appropriato o aumentare opportunamente la quantità totale di RNA in ingresso nel campione.
• Il rapporto tra perle magnetiche e campioni è troppo basso, il che influisce sulla combinazione di mRNA e perle magnetiche. Prova ad aumentare il numero di sfere magnetiche o ridurre la quantità e il volume del campione in ingresso.
• Il tempo di ibridazione è troppo breve, il tempo di incubazione può essere aumentato a 10-15 minuti;
• Se l'eluizione non è sufficiente, è necessario aumentare opportunamente il volume del tampone di eluizione, aumentare il tempo e la temperatura di eluizione oppure ripetere due volte la fase di eluizione.

(3) Come eliminare efficacemente l'rRNA?

——Se l'operazione non è corretta, l'rRNA si legherà in modo non specifico alle sfere magnetiche insieme all'mRNA durante la purificazione, soprattutto quando c'è una grande quantità di RNA totale in ingresso. Nel processo di purificazione vengono solitamente utilizzati due cicli di legatura per evitare efficacemente l'inquinamento da rRNA. Assicurarsi che sia completamente miscelato durante l'esperimento di lavaggio per rimuovere il legame non specifico e cercare di eliminare l'inquinamento da rRNA.

(4) Per molte applicazioni a valle, è necessario eluire l'mRNA? Le sfere magnetiche interferiscono con le reazioni enzimatiche a valle?

——Alcune reazioni a valle possono essere eseguite direttamente con sfere magnetiche senza eluire mRNA, come la frammentazione dell'mRNA e la trascrizione inversa nella costruzione di librerie di RNA.Tuttavia, se si devono effettuare reazioni PCR, è necessario assicurarsi che non vi sia contaminazione del DNA genomico, altrimenti verranno generati molti frammenti di amplificazione genomica, che interferiranno con i risultati sperimentali. Le operazioni dettagliate possono essere eseguite secondo le istruzioni delle corrispondenti reazioni a valle, come la costruzione della libreria RNA-Seq

(5) Il kit può separare l'mRNA direttamente dalle cellule o dai tessuti?

——Non lo consiglio! Il lisato contiene alcuni componenti che influenzeranno il legame dell'mRNA. Si raccomanda di utilizzare un kit speciale.

5. Raccomandazione del prodotto perline magnetiche Yeasen

Per quanto riguarda la lettura

Quanto ne sai sulla tecnologia NGS?

5 minuti per comprendere il passato e il presente delle perle di selezione del DNA (inclusa l'analisi dei risultati e l'interpretazione delle FAQ)