I. Principi del Western Blot
Western Blot (WB), o immunoblotting proteico, è una tecnica classica per rilevare proteine specifiche in base alle interazioni antigene-anticorpo, ampiamente utilizzata in biologia molecolare, immunologia e campi correlati. I suoi passaggi principali includono:
- Separazione delle proteine:
- La tecnica SDS-PAGE separa le proteine denaturate in base al peso molecolare.
- L'SDS ricopre le proteine con una carica negativa uniforme, eliminando le influenze strutturali.
- Trasferimento a membrana:
- Le proteine vengono trasferite dal gel a una membrana (ad esempio, PVDF o nitrocellulosa).
- Rilevamento degli anticorpi:
- Gli anticorpi primari legano specificamente la proteina bersaglio, seguiti da anticorpi secondari coniugati con enzimi (ad esempio HRP) che generano un segnale rilevabile, come la chemiluminescenza.
II. Flusso di lavoro standard Western Blot
| Fare un passo | Procedure chiave | Reagenti consigliati (Prodotti Yeasen) |
| 1. Preparazione del campione | Estrarre le proteine con il tampone di lisi RIPA; aggiungere PMSF per inibire le proteasi attività. | Serie di tamponi di lisi RIPA, PMSF |
| 2. Quantificazione delle proteine | Utilizzare il metodo BCA (Cat#20200ES) per la quantificazione; abbinare il tampone di diluizione standard al tampone campione. | Kit di quantificazione BCA (Cat#20200ES/20201ES) |
| 3. Elettroforesi SDS-PAGE | Utilizzare gel precolati e farli funzionare a 150 V finché il colorante non raggiunge il fondo del gel. | Gel pre-colati, tampone di caricamento SDS-PAGE |
| 4. Trasferimento e blocco della membrana | Attivare la membrana PVDF (Cat#36125ES) immergendo in metanolo per 1 min; trasferire a 300 mA per 60 min in un bagno di ghiaccio; bloccare a temperatura ambiente (TA) per 1 h o utilizzare una soluzione di bloccaggio rapido (Cat#36122ES) per 10 min. | Traansfer Buffer, serie membrana PVDF |
| 5. Incubazione degli anticorpi | Incubare con l'anticorpo primario a 4°C durante la notte; anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1-2 ore; lavare accuratamente con TBST 3 volte. | Diluente per anticorpi |
| 6.Rilevamento delle proteine | Sviluppare con ECL (Cat#36208ES). | Serie di chemiluminescenza ECL |
Figura 1: Flusso di lavoro Western Blot
III. Problemi comuni e soluzioni
| Problema | Possibili cause | Soluzioni |
| Background elevato  | Blocco incompleto | Utilizzare una soluzione di bloccaggio fresca e prolungare il tempo di bloccaggio. |
| Lavaggio inadeguato | Aumentare la frequenza e la durata dei lavaggi per rimuovere i legami non specifici. | |
| Concentrazione eccessiva di anticorpi primari | Diluire l'anticorpo fino a raggiungere la concentrazione appropriata. | |
| Problemi di qualità del campione | Controllare la purezza e la qualità del campione; utilizzare campioni freschi. | |
| Essiccazione a membrana | Assicurarsi che la membrana rimanga idratata durante le fasi di incubazione; garantire il contatto completo con le soluzioni di reazione. | |
| Segnale debole o assente  | Trasferimento incompleto | Verificare l'efficienza del trasferimento e regolare i tempi secondo necessità. |
| Membrana PVDF non attivata | Immergere il PVDF nel metanolo per attivarlo prima di trasferirlo nel tampone. | |
| Incompatibilità dell'anticorpo primario con la specie bersaglio | Controllare la scheda tecnica, confrontare le sequenze di immunogeni e proteine e includere un controllo positivo ampiamente utilizzato (ad esempio, β-actina nelle cellule dei mammiferi). | |
| Incompatibilità degli anticorpi primari e secondari | Assicurarsi che l'anticorpo secondario corrisponda alla specie ospite dell'anticorpo primario. | |
| Legame insufficiente degli anticorpi | Aumentare la concentrazione degli anticorpi e prolungare l'incubazione a 4°C (ad esempio, durante la notte). | |
| Bassi livelli di antigene | Caricare almeno 20-30 μg di proteine per corsia; utilizzare inibitori della proteasi e un controllo positivo. | |
| Bassa espressione della proteina bersaglio | Confermare l'espressione nel campione tramite letteratura/database; concentrare il campione o utilizzare un controllo ad alta espressione. | |
| Bande non specifiche/Bande multiple  | Linee cellulari sottoposte a passaggi eccessivi che alterano i profili proteici | Utilizzare celle a basso passaggio (<15 passaggi) ed eseguire controlli paralleli con ceppi a passaggio precoce. |
| Degradazione delle proteine | Includere gli inibitori della proteasi nel tampone di lisi; conservare a -80°C, evitare il congelamento-scongelamento, utilizzare campioni freschi. | |
| Modifiche post-traduzionali | Controllare la letteratura per le modifiche che influenzano la dimensione della banda (ad esempio, ubiquitinazione, glicosilazione). | |
| Molteplici varianti di giunzione | Verificare le varianti di splicing tramite letteratura o database. | |
| Dimeri/multimeri proteici | Aggiungere β-mercaptoetanolo fresco o DTT al tampone di caricamento SDS. | |
| Contaminazione proteica esogena | Controllare la presenza di proteine esogene; cambiare linea cellulare se necessario. | |
| Caricamento eccessivo del campione | Ottimizzare il caricamento (20-30 μg) in base all'espressione target tramite test del gradiente. | |
| Formazione di multimeri | Far bollire i campioni per 10 minuti per dissociare i multimeri | |
| Elevata concentrazione di anticorpi primari | Ridurre la concentrazione e/o il tempo di incubazione per evitare bande extra. | |
| Elevata concentrazione di anticorpi secondari | Ridurre la concentrazione e includere un controllo solo secondario per ridurre il legame non specifico. | |
| Rilevamento di proteine non segnalate o membri della famiglia | Rivedere la letteratura o BLAST; utilizzare linee cellulari/tessuti consigliati. | |
| Se ciò fosse verificato, potresti aver scoperto una nuova proteina! | ||
| Fasce sorridenti  | Migrazione rapida, temperatura elevata del buffer, sovraccarico, buffer basso | Migrazione lenta, preraffreddamento del tampone, riduzione del carico proteico, verifica che il tampone copra completamente i pozzetti. |
| Fasce accigliate  | Problemi del dispositivo (ad esempio, bolle sotto il gel) | Regolare l'impostazione per eliminare le bolle e garantire una polimerizzazione uniforme del gel. |
| Fasce di coda  | Scarsa solubilità del campione, degradazione, tampone riutilizzato | Mescolare bene i campioni, utilizzare campioni freschi, preparare un tampone di corsa fresco. |
| Fasce a forma di manubrio  | Gel non uniforme polimerizzazione, campioni impuri | Rifondere il gel per uniformità; centrifugare i campioni prima dell'uso. |
| Sbavatura della banda  | Carico eccessivo, scarsa qualità del gel | Ridurre il volume del campione, migliorare la preparazione del gel. |
| Segni di bolle  | Aria intrappolata durante il trasferimento | Eliminare le bolle durante l'assemblaggio del sandwich di trasferimento. |
| Punti neri irregolari  | Soluzione bloccante non disciolta, distribuzione non uniforme degli anticorpi | Sciogliere completamente la soluzione bloccante, lavare 3 volte con TBST, agitare durante l'incubazione. |
| Macchie bianche  | Elevata concentrazione di anticorpi che impoverisce il substrato | Concentrazioni inferiori di anticorpi primari/secondari. |
Ⅳ.Strumenti di selezione e ottimizzazione del prodotto
Yeasen offre una suite completa di reagenti per semplificare il flusso di lavoro
Prodotti correlati:
| Procedure | N. di cat. | Nome del prodotto | Specifiche |
| Preparazione del campione | 20101ES | Tampone di lisi RIPA (forte) | 100 ml |
| 20115ES | Tampone di lisi RIPA (terreno) | 100 ml | |
| 20114ES | Tampone di lisi RIPA (debole) | 100 ml | |
| 20118ES | Tampone di lisi per saggi WB/IP | 100 ml | |
| Kit di quantificazione delle proteine BCA (migliorato) | 500 tonnellate/2500 tonnellate/5000 tonnellate | ||
| Kit di quantificazione delle proteine BCA (pronto all'uso) | 500 tonnellate | ||
| Elettroforesi SDS-PAGE | Marcatore proteico Gold Band Plus a 3 colori per intervalli regolari (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| Marcatore proteico ad alto raggio GoldBand™ a 3 colori (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | Kit di preparazione del gel SDS-PAGE | 1 kit (30~50 gel)/ 1 kit (150~250 gel) | |
| Kit di preparazione rapida per gel PAGE | Concentrazioni: 8%, 10%, 12,5%, 15% | ||
| 36259ES-36280ES | Gel proteico prefabbricato Plus | Concentrazioni: 8%、10%、12%、4-12%、4-20% Opzioni di caricamento: 10 pozzi, 12 pozzi, 15 pozzi | |
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Trasferimento e blocco della membrana | Membrana PVDF da 0,45 μm (1 rotolo, 30 cm × 3 m) | 1 rotolo | |
| Membrana PVDF da 0,22 μm (1 rotolo, 30 cm × 3 m) | 1 rotolo | ||
| Incubazione degli anticorpi | 36206ES | Diluente per anticorpi primari e secondari per WB | 100 ml/500 ml |
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Rilevamento delle proteine | Reagente di rilevamento Super ECL | 100 ml/500 ml | |
| Kit substrato chemiluminescente ECL migliorato | 100 ml/500 ml |
la primaCome ottenere supporto
Per la risoluzione personalizzata dei problemi o l'ottimizzazione del protocollo:
- Visita: Pagina del prodotto Western Blot Yeasen
- E-mail: info@yeasenbio.com
Regola d'oro per il successo: Procedure standardizzate + reagenti di alta qualità + convalida passo dopo passo = risultati WB riproducibili!