大腸菌宿主細胞DNA残留物検出キット（ 2G ）
資格概要（カタログ番号：4 1308 ES60）
- 背景
このレポートにまとめられたデータは、
- 実験材料と方法
2.1 E.coli 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (2G)、ベンダー:
2.2 MolPure® 磁気残留 DNA サンプル調製キット、ベンダー:
2.3 大腸菌 DNA 含有量の国家標準: Cat. 270027、ロット番号: 201101、濃度: 96.2 μg/mL、保管条件: -70℃、購入元: 国立食品医薬品安全庁。
2.4 オリジナルデータ: 電子版は、親ファイル「E.coli 宿主細胞 DNA 残留物検出キット (2G)」のサブファイル「実験レポート」に記録されています。
2.5 方法: 実験に使用された材料と操作方法は、基本的に
- 予選内容と結果
3.1 検出範囲
キットの直線範囲は 30 fg/μL ～ 300 pg/μL で R 2 =1 であり、増幅効率は各濃度アッセイで 101.74%、CV < 15% でした。 
図1 E.coli DNA (2G) qPCR標準曲線
3.2 精度
3. 2.1大腸菌DNA含有量の国家基準からの逸脱
キットの各バッチに含まれる大腸菌 DNA 参照物質は、大腸菌 DNA 含有量の国家標準を使用して校正されています。
3. 2 . 2 回復
3.2.2.1 ブランクサンプル添加回収実験
高濃度および低濃度（それぞれ 300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL）の大腸菌 DNA 標準サンプルを調製し、残留 DNA サンプル前処理キット用の磁気ビーズ法を使用して抽出後に分析し（各サンプルに対して 2 回の抽出反復を実行し、各抽出に対して 3 回の分析反復を実行）、サンプルの回収率と CV を分析しました。
さまざまな濃度の DNA サンプルに対して、回収率は 70% ～ 130% の範囲で、CV はすべて 20% 未満でした。
|
サンプルタイプ |
理論濃度 |
抽出1平均 |
抽出2の平均 |
平均濃度 |
履歴書 |
回復 |
|
空白サンプル |
/ |
/ |
/ |
/ |
/ |
/ |
|
回復サンプル1 |
300 pg/μL |
250.56pg/μL |
262.11 pg/μL |
256.33 pg/μL |
4.41% |
85.44% |
|
回復サンプル2 |
3pg/μL |
2.29pg/μL |
2.56pg/μL |
2.42pg/μL |
7.09% |
80.77% |
|
回復サンプル3 |
30 fg/μL |
33.62 fg/μL |
32.61 fg/μL |
33.12 fg/μL |
14.28% |
110.39% |
表1 ブランクサンプルのスパイク回収率
3.2.2.2 模擬サンプルスパイク回収実験
同じ濃度（大腸菌 DNA 3 pg/μL）のサンプルを 5 つの異なるバックグラウンド溶液（高タンパク質、高核酸、高 pH および低 pH、高塩）で抽出し（各サンプルに対して 2 回の抽出反復、各抽出に対して 3 回のアッセイ反復を実行）、サンプルの回収率と CV を分析しました。
さまざまなバックグラウンド ソリューションの DNA サンプルの回収率は 70% ～ 130% の範囲で、すべての CV は 20% 未満でした。
|
サンプルタイプ |
理論濃度 |
抽出1平均 |
抽出2の平均 |
平均濃度 |
履歴書 |
回復 |
|
基本サンプル |
/ |
/ |
/ |
/ |
/ |
/ |
|
高タンパク |
3pg/μL |
2.25 |
2.23 |
2.24 |
1.09% |
74.74% |
|
高核酸 |
3.93 |
3.96 |
3.95 |
1.56% |
131.52% |
|
|
塩分が多い |
2.69 |
2.67 |
2.68 |
2.63 |
89.20% |
|
|
高pH |
2.90 |
3.67 |
3.29 |
13.82% |
109.55% |
|
|
低pH |
2.77 |
2.87 |
2.82 |
3.41% |
94.01% |
表2 基本的なサンプルスパイク回収
3.3 精度
3. 3.1再現性
3 pg/μL の濃度、CV <15% の大腸菌 DNA 標準液に対してアッセイを 10 回繰り返します。
|
繰り返し |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
平均 |
履歴書 |
|
検出値（fg/μL） |
3.16 |
2.87 |
2.97 |
2.86 |
2.81 |
2.97 |
3.14 |
3.21 |
3.14 |
3.1 |
3.02 |
4.78% |
表3 再現性の結果
3. 3 . 2 中精度
3 人の実験者が独立して、大腸菌 DNA 標準サンプルを高濃度と低濃度 (300 pg/μL、3 pg/μL、30 fg/μL) でテストし、各濃度で 3 回反復してテストしたところ、得られた 9 つのデータすべての CV は 15% 未満でした。
|
経験 |
実際の濃度 理論濃度 |
大腸菌DNA（2G） |
||
|
300 pg/uL |
3pg/μL |
30 fg/uL |
||
|
経験1 |
決意1 |
295.65 |
3.22 |
26.90 |
|
決意2 |
287.71 |
3.24 |
32.00 |
|
|
決意3 |
300.23 |
3.17 |
27.50 |
|
|
実験2 |
決意4 |
306.06 |
3.13 |
37.30 |
|
決意5 |
299.76 |
3.02 |
32.70 |
|
|
決意6 |
299.63 |
3.02 |
34.00 |
|
|
経験3 |
決意7 |
266.70 |
3.01 |
35.90 |
|
決意8 |
272.89 |
3.09 |
40.70 |
|
|
決意9 |
276.51 |
3.01 |
35.20 |
|
|
/ |
平均 |
289.46 |
3.10 |
33.60 |
|
/ |
履歴書 |
4.89% |
3.02% |
13.18% |
表4 中間精度の結果
3.4 特異性
バイオ医薬品の製造に一般的に使用される細胞ゲノムDNAの干渉について、大腸菌DNA検出試薬との干渉を評価したところ、干渉群は対照群と重複し、干渉は見られませんでした（下図は、HEK293、Vero、CHOゲノムDNAと大腸菌DNA検出試薬との干渉データを順に示しています）。
図2 干渉実験結果
3.5 定量限界
大腸菌DNAは、50 fg/μL、40 fg/μL、30 fg/μL、10 fg/μL、5 fg/μLで、各濃度で10回繰り返して検出されました。結果は、30 fg/μL以上の濃度でCVが20%未満であることを示しました。つまり、大腸菌宿主細胞DNA残留物検出キット（2G）の定量限界は30 fg/μLでした。
|
繰り返し テスト項目 |
大腸菌DNA（2G）（fg/μL） |
|
|
量 |
再計算比率 |
|
|
1 |
29.43 |
98.09% |
|
2 |
29.51 |
98.35% |
|
3 |
32.04 |
106.79% |
|
4 |
26.07 |
86.89% |
|
5 |
34.06 |
113.53% |
|
6 |
33.54 |
111.79% |
|
7 |
26.95 |
89.82% |
|
8 |
27.38 |
91.26% |
|
9 |
27.04 |
90.13% |
|
10 |
26.10 |
87.02% |
|
平均 |
29.21 |
/ |
|
履歴書 |
10.40% |
/ |
図3 30fg/μL E.coli DNA（2G）qPCRテスト結果
3.6 堅牢性
このキットはテスト済みであり、以下の機器に適していますが、これらに限定されません。
|
ベンダー |
機器モデル |
増幅効率 |
2 位 |
定量限界（fg/μL） |
履歴書 |
|
サーモ |
7500 の |
101.74% |
1 |
30 |
13.30% |
|
サーモ |
ABI QuantStudio5 |
100.46% |
1 |
30 |
12.40% |
|
バイオ・ラッド |
CFX96 |
99.20% |
0.999 |
30 |
13.76% |
|
上海紅石 |
スラン |
100.40% |
0.999 |
30 |
11.67% |
表5 機器適合性試験結果
3.7 安定性
3. 7 .1凍結融解安定性
大腸菌宿主細胞 DNA 残留物検出キット (2G) は、凍結と解凍を 10 回繰り返してテストされましたが、キットの性能には影響がありませんでした。
|
テスト指標 凍結融解時間 |
パラメータ |
T0時間 |
凍結融解10回 |
|
標準曲線パラメータ |
増幅効率 |
98.23% |
100.20% |
|
2 位 |
1 |
0.999 |
|
|
定量限界（30 fg/μL） |
履歴書 |
15.07% |
9.66% |
表6 凍結融解安定性結果分析
3. 7 . 2 加速された安定性
大腸菌宿主細胞DNA残留物検出キット（2G）は、それぞれ2～8℃で30日間、37℃で14日間保管されました。キットの性能には影響はありませんでした。
|
テスト指標 加速温度と時間 |
パラメータ |
実験1 |
実験2 |
||
|
T0時間 |
2~8℃ 30日 |
T0時間 |
37℃ 14日 |
||
|
標準曲線パラメータ |
増幅効率 |
97.77% |
99.81% |
98.39% |
98.65% |
|
2 位 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
|
定量限界（30 fg/μL） |
履歴書 |
11.04% |
13.79% |
9.55% |
14.55% |
表7 加速安定性結果分析
- 4 .参照
4.1 中国薬局方委員会（ChPC）。中華人民共和国薬局方（第3巻）[S]。北京：中国医学科学技術出版社、p.542-543、2020年。
4.2 NMPA、2007: 生物学的製品の品質管理のための分析方法検証の技術レビューに関する一般原則。
4.3 ICH(2022)《分析法バリデーションQ2》草案版。
注文情報
|
説明 |
部品番号 |
|
41332ES |
|
|
41331ES |
|
|
41307ES |
|
|
41308ES |
|
|
18461ES |
|
| MycAway™ マイコプラズマ qPCR 検出キット (2G) | 40619ES |