マイコプラズマqPCR検出と方法の検証は、細胞および遺伝子治療技術開発の進歩に貢献します。

近年、バイオメディカルの急速な発展、COVID-19パンデミック下での細胞・遺伝子治療の出現、mRNAワクチンの登場により、生物学的製品の安全性と信頼性の確保は、世界中の政府や規制機関の焦点となっています。マイコプラズマ汚染は一般的ですが、除去するのが難しいタイプの汚染です。規制要件では、細胞培養を含むバイオプロセスに対して「マイコプラズマ汚染がないことを保証する」ことが義務付けられています。

マイコプラズマ検査に関する規制当局の要件:

FDA の「業界向けガイダンス: 感染症適応症のウイルスワクチンの製造に使用される細胞基質およびその他の生物学的材料の特性評価と認定」では、原材料、ウイルス種子、未処理の採取液に対するマイコプラズマ管理が規定されています。
2020年版中国薬局方第3部「生物学的製品の製造試験に使用される動物細胞基質の調製および品質管理」では、マスター細胞バンク（MCB）、ワーキング細胞バンク（WCB）、生産終了細胞（EOPC）を含む製造細胞に対するマイコプラズマ検査が義務付けられています。
「免疫細胞治療製品の薬学研究および評価に関する技術ガイドライン（試行）」では、重要な時点で適切な中間サンプルに対してマイコプラズマの安全性に関する試験を実施すること、または関連する管理措置を実施することを推奨しています。マイコプラズマ検査は、最終製品の出荷試験としても必要です。

核酸検査（NAT）と従来の方法：

核酸増幅技術 (NAT) などの迅速な検出方法が登場する前は、従来の培養法と指標細胞アッセイが採用されていました。しかし、検出サイクルが長いことや感度の問題があるため、これらの方法では生産サイクルやリリースサイクルが長引いたり、リスク評価や代替方法の検討に基づいて細胞材料を条件付きでリリースする必要があったりすることがよくありました。細胞および遺伝子治療の進歩に伴い、業界内では、よりタイムリーで感度の高いマイコプラズマ検出方法に対する需要が高まっています。製品の保存期間が短いため、長いテスト期間を維持できないため、NAT 法が好ましい代替手段として浮上しました。

現在、欧州薬局方（EP）<2.6.7>、日本薬局方（JP）、米国薬局方（USP）<63>には、いずれもNAT法がマイコプラズマ検出法として含まれています。ただし、この方法の検証と従来の方法との比較により感度が劣っていないことを確認することが、この方法を使用するための前提条件です。2020年版の中国薬局方（ChP）では、NATはマイコプラズマ検出法として含まれていませんが、「国家医薬品規制当局が認めるその他の方法」を使用する可能性について言及しています。2022年5月、国家薬品監督管理局（NMPA）医薬品審査センターは、「免疫細胞治療製品の医薬品研究および評価に関する技術ガイドライン（試行）」を発表し、サンプル量が限られている場合や迅速なリリースが必要で薬局方の方法が不十分な場合など、特別な状況下でのリリーステスト用の新しい無菌およびマイコプラズマ検出法の開発を検討することを提案しています。したがって、NAT 法は、迅速なマイコプラズマ放出試験をサポートできる方法として、より多くの原材料サプライヤーや先進治療医薬品 (ATMP) 企業によって利用されることが予想されます。

NAT 方式 - 方式検証要件

NAT法の検証プロセスは、欧州薬局方<2.6.7>および日本薬局方に詳細に記述されており、その内容は基本的に一貫しています。国家食品医薬品監督管理研究所（NIFDC）も、「マイコプラズマ検査における核酸検出法および方法論的検証に関する考察」と題する記事を発表し、中国におけるマイコプラズマ核酸増幅法の開発者およびユーザーにガイダンスを提供することを目指しています。特異性、検出限界、および堅牢性は、マイコプラズマNAT法の検証に不可欠です。市販のキットをマイコプラズマ検出に使用する場合、方法の適合性検証は、サプライヤーの包括的なキット性能レポートと、実験室環境およびサンプルタイプに基づいて実施できます。

検証レポート

特異性:

特異性とは、他の成分（不純物、分解産物、賦形剤など）が存在する状態で分析対象物を正確に特定する分析方法の能力を指します。EP では、グラム陽性菌内のクロストリジウム、乳酸菌、連鎖球菌など、系統樹に密接に関連する他の細菌種間の交差反応に注目する必要性を強調しています。宿主細胞や実験環境におけるヒト DNA 汚染などの一般的な汚染物質の種類にも注意を払う必要があります。

検出限界:

検出限界とは、サンプルで検出できる分析対象物の最小量です。これは定性的な識別基準として機能し、正確な値として定量化する必要はありません。EP では、各希釈濃度で各マイコプラズマ種について 24 の検出データポイントが必要です。これは、異なる日に 3 回の独立した 10 倍連続希釈を行い、各希釈勾配で 8 回の繰り返し検出を行うか、異なる日に 4 回の独立した 10 倍連続希釈を行い、各希釈勾配で 6 回の繰り返し検出を行うことで達成できます。検出陽性率が 95% を超える場合、検出限界と見なすことができます。検出限界の確認が必要なマイコプラズマの種類については、キット製造業者は、規制薬局方で要求されている限り多くのマイコプラズマの種類をカバーし、各マイコプラズマの種類の検出限界を調査する必要があります。バイオ医薬品会社の場合は、ヒトのマイコプラズマの種類も考慮することをお勧めします。

製造工程中に鳥類の細胞または材料が使用されるか、またはそれらに遭遇する場合は、マイコプラズマ・シノビエの検出限界の検証を実施する必要があります。
製造工程中に昆虫や植物材料が使用されるか、または遭遇する場合は、アコレプラズマの検出限界検証を実施する必要があります。
豚の鼻腔マイコプラズマは、マイコプラズマに汚染されたサンプル中に非常に多く見られ、中国食品医薬品監督管理研究所の注目を集めています。

欧州薬局方と比較すると、日本薬局方では、検出限界の検証が必要な鳥類マイコプラズマについては言及されていませんが、唾液マイコプラズマは含まれています。

堅牢性:

堅牢性とは、測定条件の小さな変化に影響を受けることなく耐える方法の能力を指し、確立された方法を日常的なテストで使用するための基盤を提供します。堅牢性の評価では、検出試薬中の MgCl2、プライマー、および dNTP の濃度の変化、核酸抽出キットまたは抽出手順の変更、および異なる核酸増幅器の使用に対するマイコプラズマ検出方法の耐性に焦点を当てる必要があります。

比較研究

NAT を薬局方法の代替として使用する場合は、比較を通じて NAT が培養法または指標細胞培養法に代わるものであることを確認する必要があります。これには通常、方法の検出限界と特異性 (マイコプラズマのカバー範囲や偽陽性の可能性など) を考慮する必要があります。検出限界を比較するには、「10 CFU/mL の検出限界は培養法に代わることができ、100 CFU/mL の検出限界は指標細胞培養法に代わることができる」という基準を満たす必要があります。

比較研究を実施するには、次の 2 つのオプションのアプローチがあります。

検出限界を確認するために、NAT 法と薬局方法の両方で同じ検証済みのマイコプラズマ株を使用して同期実験を実施します。
NAT 検証の結果を以前の薬局方メソッド検証の結果と比較しますが、両方のメソッドで使用されるマイコプラズマ標準の確認ファイルを注意深く文書化する必要があります。

説明	部品番号
MolPure® 磁気残留 DNA サンプル調製キット	18461ES
MycAway™ マイコプラズマ qPCR 検出キット (2G)	40619ES