누드 마우스에서 종양 성장을 실시간으로 제어하고 싶으신가요? 마우스에서 세포 식민지화 위치를 알고 싶으신가요? 생체 내 종양에 대한 약물 치료 효과를 알고 싶으신가요? 이는 세포에 추적기를 설치하여 언제든지 세포의 위치와 수를 제어할 수 있게 함으로써 달성할 수 있습니다. 이 기술은 생체 내 영상 "검출" 기술입니다. 그렇다면 생체 내 영상 기술이란 무엇일까요?

1. 생체 내 영상 기술이란 무엇입니까?
2. 루시퍼라제 이미징의 특징
3. 루시퍼라제 이미징의 응용 방향
4. 실험 사례 공유
5. 자주 묻는 질문
6. 제품 정보
7. 독서에 관하여

1. 생체 내 영상 기술이란 무엇입니까?

1999년 초, 미국 하버드 대학의 바이스레더 박사는 분자 영상이라는 개념을 제안했습니다. 즉, 영상 방법을 사용하여 세포 및 분자 수준에서 생체 내 생물학적 과정에 대한 정성적 및 정량적 연구를 수행하는 것입니다. 생체 내 영상은 분자 영상에 기반합니다. 이 영상 시스템을 통해 종양 성장 및 전이, 감염성 질환의 발병 및 특정 유전자의 발현과 같은 생물학적 과정을 살아있는 동물에서 관찰할 수 있습니다.

생체 내에서 살아있는 동물의 광학적 영상은 주로 생물 발광과 형광의 두 가지 기술을 채택합니다. 생물 발광은 세포 또는 DNA를 표시하는 루시퍼라제 유전자인 반면 형광 기술은 녹색 형광 단백질 및 적색 형광 단백질과 같은 형광 리포터 유전자와 FITC, Cy5 및 Cy7과 같은 형광을 사용합니다. 표지를 위한 요소 및 양자점(QD). 포유류 생물 발광은 일반적으로 반딧불이 루시퍼라제 유전자(약 50KD, 554개 뉴클레오티드로 구성됨), 즉 루시퍼라제 유전자를 예상 관찰 세포의 염색체 DNA에 통합하여 루시퍼라제를 발현합니다. 그런 다음 루시퍼라제를 안정적으로 발현할 수 있는 세포주를 배양하고 세포가 분열, 분화 및 전이될 때 루시퍼라제 역시 안정적으로 발현됩니다. 유전자, 세포 및 살아있는 동물은 모두 루시퍼라제 유전자로 태그를 지정할 수 있습니다. 루시퍼라제는 기질을 촉매하여 생물 발광을 생성할 수 있는 일종의 효소입니다. 다양한 출처의 루시페라아제는 각자의 특성을 가지고 있으며 기질을 촉매하여 다양한 색상의 빛을 방출할 수 있습니다. 그중에서도 반딧불이 루시페라아제는 민감도가 높고 선형 범위가 7~8배 넓습니다. 가장 흔히 사용되는 포유류 세포 리포터 유전자가 되었습니다. 루시페라아제 리포터 플라스미드를 세포로 옮기고 기질인 루시페린을 첨가하여 세포를 배양했습니다. ATP, O ₂ 및 마그네슘 이온이 있는 경우 루시페라아제는 루시페린 기질을 산화시켜 가시광선 반응을 생성할 수 있습니다. "일회성 '추적기' 설치 및 언제든지 추적 및 감지"를 실현합니다. 반딧불이 루시페라아제 외에도 레닐라 루시페라아제가 때때로 사용됩니다. 두 가지의 기질은 다르며 전자의 기질은 D-루시페린이고 후자의 기질은 코엘렌테라진입니다. 두 가지의 발광 파장은 다르며, 전자가 방출하는 광 파장 범위는 540-600nm이고 후자가 방출하는 광 파장 범위는 460-540nm이다. 전자가 방출하는 빛은 조직을 통과하기 쉬운 반면, 후자는 체내에서 더 빨리 대사되며 특이성은 전자만큼 좋지 않다. 따라서 대부분의 생체 내 실험은 반딧불이 루시퍼라제를 리포터 유전자로 사용하지 않는다.

그림 1. 루시퍼라아제 표지 세포의 국소화

생물발광의 광학 원리: 빛은 포유류 조직에서 전파될 때 산란되고 흡수되고, 광자는 세포막과 세포질을 만날 때 굴절되며, 다양한 유형의 세포와 조직은 광자를 흡수하는 특성이 다릅니다. 헤모글로빈은 신체에서 가시광선을 흡수하는 주요 원인이며 가시광선의 청록색 대역을 대부분 흡수할 수 있습니다. 그러나 600nm 이상의 가시광선의 적색광 대역에서는 헤모글로빈의 흡수가 매우 적습니다. 따라서 많은 양의 빛이 조직과 피부를 통과하여 붉은색 영역에서 감지될 수 있습니다. 살아있는 동물의 생물발광 영상 기술을 사용하여 최소 수백 개의 피하 세포를 감지할 수 있습니다. 그러나 마우스의 광원 깊이에 따라 볼 수 있는 최소 세포 수가 다릅니다. 일반적으로 1cm 증가할 때마다 광도는 10배로 감쇠되며, 혈액이 풍부한 조직과 장기는 감쇠가 더 크고 뼈에 인접한 조직과 장기는 감쇠가 적습니다. 동일한 깊이의 경우 감지된 광도는 세포 수와 상당한 선형 관계를 가지며, 감지된 광도는 세포 수를 반영하기 위해 기기로 정량화할 수 있습니다.

그림 2. 루시페라아제와 루시페린 칼륨염 반응의 발광 원리

생물발광과 달리 형광 기술은 형광 리포터 유전자 또는 형광 염료(형광 양자점과 같은 새로운 나노 라벨링 물질 포함)를 사용하여 라벨을 붙입니다. 리포터 유전자, 형광 단백질 또는 염료의 형광을 사용하여 생체 내 생물학적 광원을 만들 수 있습니다. 생물발광은 여기 광원이 없는 동물의 자가 형광인 반면, 형광은 이미징 시스템에서 감지하기 전에 외부 여기 광원에 의한 여기가 필요합니다. 형광 라벨은 동물, 세포, 미생물, 항체, 약물, 나노물질 등을 포함하여 널리 사용됩니다.

2. 루시퍼라제 이미징의 특징

◎ 방사선이 없어 생물체에 거의 무해합니다.

◎ 여기광원이 없는 생물발광.

◎ 민감도가 높아 수백개의 세포를 검출할 수 있습니다.

◎ 침투성이 우수하여 3-4cm 조직 깊이도 감지 가능합니다.

◎ 높은 신호대잡음비, 강력한 형광신호, 우수한 간섭방지성을 가지고 있습니다.

3. 루시퍼라제 이미징의 응용 방향

3.1 종양 성장

누드 마우스를 대상으로 한 종양 형성 실험에서는 침습 없이 실시간으로 종양 성장을 관찰했으며, 측정을 위해 종양을 벗겨낼 필요가 없었습니다.

3.2 종양학 약물

투여가 종양의 성장이나 전이에 미치는 영향을 확인하였고, 형광물질 기질은 약물 실험을 방해하지 않고 3시간 이내에 제거될 수 있었습니다.

3.3 세포 국소화

동물에서 이물질 세포의 국소화와 분포가 감지되었습니다.

3.4 유전자 발현 조절

표적 유전자 또는 표적 유전자의 프로모터를 루시퍼라제 유전자와 융합시켜 약물 치료 또는 질병 경과 중에 발생하는 유전자 발현 변화를 검출했습니다.

3.5 줄기세포 연구

줄기세포의 이식, 생존 및 증식을 모니터링합니다. 생체 내에서 줄기세포의 분포 및 이동을 추적합니다.

4. 실험 사례 공유

그림 3. 마우스 에 HN4 세포를 피하 주사하여 종양 형성에 대한 CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 T 세포의 치료 효과를 생체 내 영상으로 검출 ^[1] .

그림 4. HUC-MSC 세포를 마우스 골격근에 주입한 후, 생체 내 이미징을 통해 세포의 국소화를 확인했습니다(빨간색 화살표로 표시) ^[2] .

그림 5. 화상 부위로의 중간엽 줄기 세포(MSC) 이동을 감지하는 생체 내 이미징의 능력. 중간엽 줄기 세포(MSC/FLuc)를 마우스 등 화상 모델에 정맥 주사했습니다. 주사 4일 후, 화상 상처의 손상된 부위에 생물 발광 신호가 나타난 후 점차 감소했습니다(빨간색 화살표는 화상 부위를 나타냄) ^[3] .

5. 자주 묻는 질문

Q1: 기존 기술과 비교했을 때, 생물발광 이미징 기술의 장점은 무엇입니까?

이 기술은 전통적인 기술과 비교했을 때 종양 전이, 유전자 치료, 역학, 줄기 세포 추적, 백혈병 및 기타 관련 연구의 전통적인 방법보다 더 민감합니다. 또한 일련의 형질 전환 동물 질병 모델을 통해 관련 질병의 병인 및 약물 스크리닝을 빠르고 직관적으로 연구할 수 있습니다.

Q2: 루시퍼라제 유전자로 줄기세포를 표시하는 방법은 무엇입니까?

구성적으로 발현된 유전자는 형질전환 마우스를 만들기 위해 라벨링될 수 있으며, 줄기 세포는 라벨링됩니다. 조혈 줄기 세포는 마우스의 골수에서 채취되어 다른 마우스의 골수에 이식됩니다. 이 기술은 신체에서 조혈 줄기 세포의 증식, 분화 및 이동을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 또 다른 방법은 줄기 세포에 렌티바이러스를 라벨링하는 것입니다.

Q3: 형광물질 주입 후 얼마 동안 검사를 실시하는 것이 적절하며, 발광은 얼마나 오래 지속될 수 있습니까?

일반적으로 형광 신호는 복강 내 주사 후 10-15분 동안 가장 강한 안정 기간에 도달하고 20-30분 후에 감소하기 시작합니다. 3시간 후에 형광 물질이 제거되고 발광이 완전히 사라집니다.

Q4: 마우스에 플루오레세인을 주입하는 방법은? 주입 방법의 차이점은 무엇입니까?

플루오레세인은 복강내 주사 또는 꼬리 정맥 주사로 마우스에 주입할 수 있습니다. 약 1분 안에 마우스의 전신으로 퍼질 수 있습니다. 대부분의 경우 플루오레세인의 농도는 150mg/kg입니다. 20g 마우스의 경우 약 3mg의 플루오레세인을 사용할 수 있습니다. 복강내 주사의 경우 확산이 느리고 초기 발광이 느리며 연속 발광 시간이 깁니다. 꼬리 정맥 주사의 플루오레세인의 경우 빠르게 확산되고 빠르게 빛을 방출하지만 발광 지속 시간이 짧습니다.

6. 제품 정보

Yeasen은 분자, 단백질, 세포 등 3대 생물학적 시약의 연구, 개발, 생산, 판매에 종사하는 생명공학 기업입니다. Yeasen에서 제공하는 제품은 다음과 같습니다.

표 1. 제품 정보

7. 독서에 관하여

새로운 세대의 루시퍼레이즈 리포터 유전자 검출 시스템 - 더욱 쉽고, 더욱 민감하고, 더욱 정확합니다.