1 제네티코마이신의 작용 원리

제네토마이신(Geneticin, G418)은 원핵 및 진핵 세포에서 70S 및 80S 리보솜에 결합하여 펩타이드 사슬 연장을 차단하여 단백질 합성을 억제하는 아미노글리코사이드 항생제입니다. 이 메커니즘은 박테리아, 효모, 식물 및 포유류 세포를 포함한 세포에 독성이 있습니다. 세포가 성공적으로 형질 전환되고 네오마이신 내성 유전자(예: neo 유전자)와 통합되면 유전자 인코딩 아미노글리코사이드 인산전달효소(APH(3) II)가 G418을 공유 결합으로 변형하여 불활성화할 수 있으므로 G418이 포함된 선택 배지에서 자란 세포에 내성을 부여할 수 있습니다.

분자 유전학 검사에서 G418은 안정적인 형질 전환에 가장 흔히 사용되는 것 중 하나입니다.

2. 제네노마이신의 응용

2.1 안정적인 형질전환 세포주 스크리닝

• G418은 단백질 합성을 억제하여 저항 유전자(예: 신생 유전자)를 포함하는 세포를 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 저항 유전자에 의해 인코딩된 아미노글리코사이드 인산전달효소는 G418을 불활성화하여 세포가 G418에 대한 저항성을 부여합니다. 일반적으로 포유류 세포 스크리닝 범위는 200~2000μg/mL이며 가장 일반적으로 사용되는 작업 농도는 100~700μg/mL입니다. 식물 세포가 10~100μg/mL이고 효모 세포가 500~1000μg/mL인 경우, 다음은 G418을 참고로 사용하여 일부 세포 유형에 사용된 농도입니다.

셀	애플리케이션	제네노마이신의 활성화 농도(μg/mL)	인용된 작품
무코르 종	a) 성장배지에서 배양 b) 동결건조 박테리아에서 배양	가) 10μg/mL 나) 30μg/mL	Hirth 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 제79권, 7356-7360(1982).
포유류	a) 스크리닝을 위해 b) 성장 유지를 위해	가) 400~1000μg/mL 나) 200μg/mL	Canaani 및 Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., 제79권, 5166-5170(1982).
식물	a) 스크리닝을 위해 b) 성장 유지를 위해	가) 25~50μg/mL 나) 10μg/mL	우르시크 등 al., Biochem. 생물 물리학. 결의안. Comm., v. 101:3, 1031-1037(1981).
누룩	a) 스크리닝을 위해 b) 성장 유지를 위해	가) 500μg/mL 나) 125~200μg/mL	Jimenez 및 Davies, Nature, v. 287, 869-871(1980).
박테리아	스크리닝을 위해	16μg/mL	Waitz 외, 항균제 화학요법제, 제6권:5, 579-581(1974).

2.2 유전자 녹아웃과 유전자 전이

• 유전자 녹아웃에서 G418은 표적 유전자를 성공적으로 녹아웃한 세포를 스크리닝하는 데 사용될 수 있습니다. 유전자 전이에서 G418은 숙주 세포의 게놈으로 외래 유전자를 통합하는 것을 용이하게 합니다.

2.3 세포 배양에서의 저항 선택

• 세포 배양 중에 G418은 항생제에 내성이 있는 세포를 선별하는 데 사용되며, 이러한 세포는 종종 특정 내성 유전자를 가지고 있습니다.

3. 제네오마이신에 대한 관련 실험 절차

3.1 G418 스톡 용액(50 mg/mL, 활성 농도)의 제조

1) 활동 단위 변환

다음 공식을 사용하여 변환합니다: (1000/A0) × A1 = A2, 여기서 A0는 배치에 따라 달라지는 G418의 효능입니다. 해당 배치의 품질 관리 보고서나 병의 라벨을 참조하세요. A1은 준비할 G418의 원하는 활성 농도입니다. A2는 무게를 측정할 실제 분말 대 부피 농도입니다.

예를 들어, G418 배치의 효능이 750 U/mg이고 활성 농도를 50 mg/mL로 준비하려는 경우, 실제로 준비해야 할 분말 농도는 1000/750 × 50 mg/mL = 66.67 mg/mL입니다.

G418 스톡 용액(활성 농도, 50 mg/mL) 10 mL을 준비하는 경우, 666.7 mg의 분말이 필요합니다.

• 살균 및 보관

위의 환산으로 얻은 실제 분말 무게를 기준으로, 멸균 탈이온수 10mL에 첨가하여 완전히 용해시킵니다.

먼저 0.22 μm 주사기 필터를 멸균 탈이온수 5 mL로 미리 적셔 모든 물을 제거합니다. 그런 다음 이 필터를 사용하여 여과하여 멸균하고 소량으로 나누어 일회용(예: 1 mL)으로 사용하고 -20°C에서 1년간 안정성을 유지합니다.

3.2 Kill Curve 설정

1) 첫째 날: 형질전환되지 않은 세포를 적절한 배양 플레이트에 20-25% 세포 밀도로 도말하고 37°C, CO ₂ 에서 밤새 배양합니다.

2) 세포 유형에 따라 적절한 범위 내에서 농도 구배를 설정하고 최소 6가지 농도를 선택합니다(G418은 분열 단계의 세포에 가장 활성이 강하므로 G418을 첨가하기 전에 일정 기간 동안 세포를 배양해야 함). 예를 들어 포유류 세포의 경우 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL을 설정합니다.

3) 2일차: 기존 배양 배지를 제거하고 해당 농도의 약물이 포함된 새로 준비한 배지로 교체합니다. 각 농도별로 3회 반복합니다.

4) 3~4일마다 약물이 포함된 새로운 배지로 교체하세요.

5) 고정된 간격(예: 2일마다)으로 생세포 수를 계산하여 형질감염되지 않은 세포의 성장을 막는 적절한 농도를 결정합니다. 안정적인 형질감염 세포주 스크리닝을 위한 작업 농도로 이상적인 일수(일반적으로 7-10일) 내에 대부분의 세포를 죽일 수 있는 가장 낮은 농도를 선택합니다.

3.3 안정적인 형질전환 세포의 스크리닝

• Yisheng Biotech에서 제공하는 G418 Geneticin(60220ES)은 효능이 ≥720 U/mg이고, 순도가 ~98%이며, 배치 안정성이 뛰어나고 가격은 다른 회사의 G418 제품의 약 1/3에 불과합니다.
• 약물이 들어 있는 스크리닝 매체는 3~4일마다 교체되었습니다.
• 세포 클론(콜로니)의 형성은 선택 7일 후에 관찰 및 평가되었습니다. 콜로니는 숙주 세포 유형, 형질감염 및 스크리닝 효능에 따라 형성되는 데 1주일 이상 걸릴 수 있습니다.
• 5~10개의 내성 클론을 골라 35mm 세포 배양판으로 옮긴 후 약물이 함유된 스크리닝 배지에서 7일간 추가로 관리했습니다.
• 일반 매체 문화를 바꾼 후.

4. 제품 추천

Yeasen Biotech에서 제공하는 G418 Geneticin( 60220ES )은 효능이 ≥720 U/mg이고, 순도가 ~98%이며, 배치 안정성이 뛰어나며 가격은 다른 회사의 G418 제품의 약 1/3에 불과합니다.

사양	에스*	티*	예센	예센의 장점
콘텐츠(HPLC)	/	/	~98%	고순도
효능(U/mg)	≥720µg/mg	707-721마이크로그램/밀리그램	≥720µg/mg	높은 효과
가격($/5g)	~1000	~1000	~200	염가

5 실험 사례

대장균에서 G69와 G99는 두 가지 다른 배치였으며, 게노마이신 농도는 각각 8 mg/L, 12 mg/L 및 16 mg/L이었고, 효과적인 최소 농도는 16 mg/L로, 각종 세균의 성장을 완전히 억제했습니다.