그림 1 AbA의 구조식, CAS#127785-64-2

연구에 따르면 Saccharomyces cerevisiae의 AUR1 유전자와 Aspergillus nidulans의 AURA 유전자는 상동성이 있으며, 둘 다 IPC 합성효소를 인코딩합니다. 따라서 이 두 유전자의 돌연변이는 돌연변이 유전자 AUR1-C와 같은 균주에 강력한 AbA 내성을 부여할 수 있습니다. AbA는 양성 클론을 스크리닝하기 위한 약물 선택 마커로 매우 적합하며, 매우 낮은 배경을 가진 조건 최적화가 필요하지 않습니다. AbA 내성은 또한 효모 단일/이중 하이브리드 연구에 이상적인 리포터이며 해당 내성을 지닌 효모 하이브리드 시스템과 호환됩니다.

효모 싱글/더블 하이브리드 시스템이란?

효모 투-하이브리드 시스템(Yeast two-hybrid assay)은 Fields와 Song 등이 진핵생물 전사 조절의 특성을 바탕으로 만들어낸 것입니다. 알려진 단백질 간의 상호작용을 빠르고 직접적으로 분석할 수 있으며 항원-항체 상호작용 연구, 새로운 단백질과 새로운 단백질 기능 발견, 약물 표적 스크리닝, 유전체 단백질 연결 지도 작성에 널리 사용됩니다. 효모 투-하이브리드의 원리는 진핵생물의 전사 활성제가 DNA 결합 도메인(DNA 결합 도메인, DNA-BD)과 DNA 전사 활성화 도메인(활성화 도메인, AD)의 두 가지 다른 구조적 도메인을 포함하고 있다는 것입니다. 이 도메인은 서로의 기능에 영향을 미치지 않고 독립적으로 분리할 수 있습니다. BD와 AD만으로는 전사 반응을 활성화할 수 없으며, 두 도메인이 공간적으로 충분히 가까울 때만 완전한 전사 활성제의 활성을 나타내어 하류 유전자가 전사될 수 있습니다. 연구 대상인 두 단백질(단백질 X와 단백질 Y)의 융합 플라스미드를 각각 BD와 AD 도메인을 가지도록 구성하고 동일한 효모 세포에서 이를 발현시켰을 때, 두 단백질 사이에 상호작용이 없다면 리포터 유전자는 전사되지 않을 것입니다. 두 단백질이 상호작용을 한다면 BD와 AD 도메인은 공간적으로 가까워질 것이므로 리포터 유전자가 전사될 것입니다.

그림 2 효모 2-하이브리드의 원리도 ^[1]

효모 원-하이브리드 기술은 효모 투-하이브리드를 기반으로 개발된 핵산-단백질 상호작용을 연구하는 도구로, 알려진 DNA와 알려진 단백질 사이에 상호작용이 있는지 확인하는 것과 같이 진핵 세포에서 유전자의 발현 조절을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 표적 cis-조절 요소 또는 다른 짧은 DNA 결합 부위에 결합하는 새로운 단백질을 분리합니다. 상호 작용하는 것으로 입증된 DNA 결합 부위를 정확하게 찾고 단백질의 DNA 결합 도메인을 분석합니다. 기본 원리는 가장 기본적인 프로모터(최소 프로모터, Pmin)의 상류에 알려진 cis-작용 요소를 구성하고 Pmin 하류에 리포터 유전자를 연결하는 것입니다. 테스트할 전사 인자를 인코딩하는 cDNA는 효모 AD 도메인 발현 벡터와 융합되어 효모 세포에 도입됩니다. 이 유전자의 생성물이 cis-작용 요소에 결합할 수 있으면 Pmin 프로모터를 활성화하여 리포터 유전자가 발현될 수 있습니다.

그림 3 효모 원-하이브리드의 원리도 ^[2]

효모 단일/이중 하이브리드 연구를 위해 Yeasen은 제품 60231ES Aureobasidin A(AbA) 를 제공합니다. 이 제품은 메탄올에 용해된 AbA 용액으로 순도 ≥ 97%, 농도 1 mg/mL입니다. Yeasen은 효모 단일/이중 하이브리드 실험에서 100-1000 ng/mL의 AbA 저해 농도를 권장하며, 특정 작업 농도는 숙주 세포의 민감도에 따라 달라집니다(다음 표, 다양한 효모 균주에 대한 AbA의 최소 저해 농도(MIC) 참조).

박테리아 균주		최소침습농도( MIC) (n g/mL )
S.세레비시아에	ATCC9763(이배체)	200~400
	SH3328(단수체)	100
	사케 효모(2배체)	100~200
	소주 효모(2배체)	100
	맥주 효모(3배체 또는 4배체)	100
	빵효모(이배체)	200~400
스키조폼베	JY-745(단배체)	100
알비칸스	TIMM-0136(이배체)	40
C.트로피칼리스	TIMM-0324(이배체)	80

적용 사례

GmSAGT1 유전자의 프로모터에 대한 GmWRKY31 단백질의 결합 부위를 연구하기 위해, 효모 원-하이브리드 실험에서 표적 DNA 서열을 AUR1-C 유전자의 상류에 위치한 우라실 리포터 유전자 Ura3를 함유하는 pBait-AbAi 벡터에 삽입하였다. 해당 플라스미드로 효모 형질전환 후, 0.9% NaCl 용액에 현탁시키고, OD600을 0.005로 조정하였다. 이어서, 샘플 100 μL를 500 ng/mL AbA를 함유하는 플레이트에 도말하여 역전시키고, 30℃에서 3-5일 동안 배양하였다 ^[3] .

그림 3 F16, F20, F73, delF16, delF20 또는 delF73 단편을 함유하는 효모 균주와 GmWRKY31 단백질의 상호작용.

우리 시약을 사용한 출판된 기사

[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li, et al. 질소는 벼의 꽃 조절자를 통해 개화 시간과 질소 사용 효율을 조절합니다, Current Biology, 제31권, 제4호, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (IF: 10.834 )

[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. 연꽃의 개화 조기 종료를 유도하는 그늘의 NnSnRK1 중심 조절 네트워크, 환경 및 실험 식물학, 제221권, 2024년, 105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (IF: 5.7 )

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참조 문서

[1] Paiano A, et al. 상호작용 단백질을 식별하기 위한 효모 Two-Hybrid Assay.Curr Protoc Protein Sci. 2019년 2월;95(1):e70.

[2] John S, et al. Yeast one-hybrid 분석: 역사적 및 기술적 관점. 방법. 2012년 8월;57(4): 441-447.

[3] Dong H, et al. Peronospora manshurica 감염에 대한 반응으로 대두 WRKY TF의 전사체 분석. Genomics. 2019년 12월;111(6):1412-1422.