1. 행동 원칙
히그로마이신 B는 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스의 대사를 통해 생성되는 아미노글리코사이드계 항생제로, 전위를 방해하고 80S 리보솜의 오독을 촉진하여 단백질 합성을 억제하고, 이를 통해 원핵세포와 진핵세포를 죽입니다.
현재는 하이그로마이신 저항성 유전자를 포함하는 원핵세포나 진핵세포를 스크리닝하고 유지하는 데 흔히 사용됩니다.
2. 응용 프로그램
2.1 Hph + 벡터 로 안정적으로 형질 전환된 원핵 또는 진핵 세포(식물 세포 및 포유류 세포)의 스크리닝 및 배양 유지대장균에서 유래된 히그로마이신 B 내성 유전자(hyg 또는 hph)는 히그로마이신 B 인산전달효소를 인코딩하는데, 이 효소는 히그로마이신 B를 생물학적으로 불활성인 인산화 생성물로 전환하여 해독시킨다. 이 원리에 따르면, 히그로마이신 B는 히그로마이신 내성 유전자로 성공적으로 형질전환된 배양된 원핵세포나 진핵세포를 선별하고 유지하는 데 매우 유용한 선택 마커이다.
2.2 작용 모드의 차이로 인해, 하이그로마이신 B는 종종 제네티신 G418, 블레오마이신 및 블라스티시딘과 함께 사용되어 두 가지 다른 벡터로 안정적으로 형질전환된 세포주를 스크리닝합니다.히그로마이신 B는 G418(제품번호 60220ES), 블레오마이신(제품번호 60257ES) 및 블라스티시딘(제품번호 60218ES)과 작용 기전이 다르기 때문에 이중 선택 실험에서 다른 선택적 항생제와 병용하여 사용하기에 적합합니다.
2.3 항바이러스제2.4 구충제로 동물사료에 첨가하거나 동물을 사육합니다.
2.5 안정적으로 형질전환된 세포의 스크리닝
안정한 형질전환체를 스크리닝하는 데 사용되는 하이그로마이신 B의 작업 농도는 세포 유형, 배지, 성장 조건 및 세포 대사율에 따라 다릅니다. 권장 농도는 50-1000μg/mL입니다. 실험 시스템을 처음 사용하는 경우 최적의 스크리닝 농도는 킬 곡선, 즉 용량-반응 곡선을 설정하여 결정하는 것이 좋습니다. 일반적으로 포유류 세포의 경우 50-500μg/mL, 박테리아/식물 세포의 경우 20-200μg/mL, 진균의 경우 200-1000μg/mL입니다.
3 프로토콜
3.1 보관용액(50 mg/mL)의 제조
0.5g의 하이그로마이신 B를 달아 10mL의 1×PBS, pH 7.4를 첨가합니다. 완전히 용해시킨 후, 멸균을 위해 0.22μm 필터로 여과합니다. 멸균된 용액을 분주하여 -20℃에서 보관합니다.
3.2 일반적으로 사용되는 스크리닝 농도
안정한 균주를 스크리닝하기 위한 하이그로마이신 B의 작업 농도는 세포 유형, 배양 배지, 성장 조건 및 세포 대사율에 따라 다릅니다. 최적의 스크리닝 농도를 처음으로 결정하기 위해 킬 곡선(용량-반응 곡선)을 설정하는 것이 좋습니다. 일반적으로 포유류 세포: 50-500μg/mL; 박테리아/식물 세포: 20-200μg/mL; 진균: 300-1000μg/mL.
3. 3 킬링커브의 확립
【참고】안정한 세포주를 스크리닝하기 위해서는 형질감염되지 않은 숙주 세포를 죽일 수 있는 항생제의 최소 농도를 결정해야 합니다. 이는 살상 곡선(용량-반응 곡선)을 수립하여 달성할 수 있습니다. 최소 5가지 농도를 배열해야 합니다.
1) 1일차: 형질전환되지 않은 세포를 20-25%의 세포 밀도로 적절한 배양판에 깔고 밤새 배양합니다. 【주의】생명력을 감지하기 위해 더 높은 밀도가 필요한 세포의 경우 접종 세포의 양을 늘릴 수 있습니다.
2) 세포 유형에 따라 적절한 범위 내에서 농도 구배를 설정합니다. 포유류 세포는 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL로 설정할 수 있습니다. 하이그로마이신 B 용액을 탈이온수 또는 PBS 완충액으로 1:10으로 희석하여 5 mg/mL로 만듭니다. 그런 다음 다음 표에 따라 용액을 해당 작업 농도로 희석합니다.
|
최종 농도(μg/mL) |
중간 용량(mL) |
5 mg/mL 하이그로마이신 B의 첨가량(mL) |
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50 |
9.9 |
0.1 |
|
100 |
9.8 |
0.2 |
|
250 |
9.5 |
0.5 |
|
500 |
9.0 |
1.0 |
|
750 |
8.5 |
1.5 |
|
1000 |
8.0 |
2.0 |
3) 2일차: 해당 농도의 약물을 함유한 신선하게 준비한 배지로 교체합니다. 각 농도에 대해 세 개의 평행 샘플을 만듭니다.
4) 3~4일마다 약물이 포함된 새로운 배지로 교체하세요.
5) 살아있는 세포 계수는 고정된 주기(예: 2일마다)로 수행되어 형질감염되지 않은 세포의 성장을 방지하기 위한 적절한 농도를 결정합니다. 안정된 세포주를 스크리닝하기 위한 작업 농도로 이상적인 일수(일반적으로 7-10일) 내에 대부분의 세포를 죽이는 최소 농도를 선택합니다.
3.4 안정적인 형질전환 세포의 스크리닝
1) 형질감염 48시간 후, 세포는 적절한 농도(직접 또는 희석)의 하이그로마이신 B를 함유한 스크리닝 배지로 계대 배양되었습니다. 【참고】항생제는 활발하게 분열하는 세포에 가장 효과적입니다. 세포가 너무 조밀하면 항생제가 세포를 죽이지 못합니다. 세포가 25% 이상 합류되지 않도록 세포를 분할합니다.
2) 3~4일마다 선별매체를 교체하세요.
3) 스크리닝 7일 후 세포 콜로니 형성을 측정합니다. 콜로니 형성은 숙주 세포 유형, 형질감염 및 스크리닝 효과에 따라 1주일 이상 걸릴 수 있습니다.
4) 5~10개의 내성 클론을 골라 35mm 세포 배양 플레이트로 옮긴 후, 약물이 함유된 스크리닝 배지에서 7일간 배양합니다.
5) 배양을 위한 약물이 첨가되지 않은 새로운 배지로 교체합니다.
4개의 속성
히그로마이신 B는 특수한 냄새가 나는 흰색에서 황갈색 분말로, 물, 메탄올, 에탄올 등에 쉽게 용해되고 많은 유기산, 무기산과 쉽게 염을 형성합니다.
5 제품 보관
본 용액은 2~8℃에서 직접 보관이 가능하며 6개월 이상 보관이 가능합니다.
6 주의
1) hph 유전자를 형질전환한 세포는 하이그로마이신에 내성을 가지며, 형질전환된 세포는 안정적으로 또는 일시적으로 유전자를 발현한다.
2) 하이그로마이신 B 내성 유전자(hyg 또는 hph)는 E. Coli 이외에도 Streptomyces hygroscopicus 및 Klebsiella pneumoniae를 포함한 다른 균주에서도 발견되었습니다.
7. 제품 추천
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제품 이름 |
고양이# |
사양 |
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히그로마이신 B(50mg/mL) |
60224ES03 |
1g(20ml) |
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60224ES10 |
10×1g(20mL) |
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|
히그로마이신 B |
60225ES03 |
1g(그램) |
|
60225ES10 |
10g |
8 우리 시약으로 출판된 논문
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제품 이름 |
고양이# |
사양 |
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시프로플록사신염산염 |
60201ES05/25/60 |
5/25/100g |
|
암피실린, 나트륨염 |
60203ES10/60 |
10/100g |
|
독시사이클린 하이클레이트 |
60204ES03/08/25 |
1/5/25g |
|
클로람페니콜, USP 등급 |
60205ES08/25/60 |
5/25/100g |
|
카나마이신 황산염 |
60206ES10/60 |
10/100g |
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테트라사이클린 HCl 테트라사이클린 염산염(USP) |
60212ES25/60 |
25/100g |
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반코마이신염산염 |
60213ES60/80/90 |
100mg/1g/5g |
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젠타마이신 황산염 |
60214ES03/08/25 |
1/5/25g |
|
스펙티노마이신 염산염 |
60215ES08 |
5g |
|
플레오마이신(용액 중 20 mg/mL) |
60217ES20/60 |
20/5×20mg |
|
블라스티시딘 S (블라스티시딘) |
60218ES10/60 |
10/10×10mg |
|
니스타틴 |
60219ES08 |
5g |
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G418 황산염(제네티신) |
60220ES03/08 |
1/5g |
|
푸로마이신(용액 10mg/mL) |
60209ES10/50/60/76 |
1×1 /5×1 / 1 0×1 /50×1 mL |
|
푸로마이신 디하이드로클로라이드 |
60210ES25/60/72/76/80 |
25/100/250/500mg/1g |
|
히그로마이신 B(50mg/mL) |
60224ES03 |
1g(20mL)/10×1g(20mL) |
|
히그로마이신 B |
60225ES03/10 |
1/10g |
|
에리스로마이신 |
60228ES08/25 |
5/25g |
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티멘틴 |
60230ES07/32 |
3.2/10×3.2g |
|
아우레오바시딘 A(AbA) |
60231ES03/08/10 |
1/5×1/10×1mg |
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폴리믹신 B 황산염 |
60242ES03/10 |
1/10뮤 |