세포사멸은 일반적으로 세포 발달 중 또는 일부 요인의 작용 하에 세포 내 유전자와 그 생성물을 조절하여 발생하는 일종의 프로그램된 세포 사멸을 말합니다. 세포사멸은 배아 발달 및 형태 형성, 조직 내 정상 세포 집단의 안정성, 신체의 방어 및 면역 반응, 질병이나 중독으로 인한 세포 손상 및 노화, 종양의 발생 및 진행에 중요한 역할을 하며 잠재적인 치료적 의의가 있습니다.

세포사멸 경로의 사건들은 시간 순서대로 발생합니다. 즉, 사건들은 순차적으로 발생하고 결국 세포사멸체가 출현하고 세포사멸이 발생합니다.

일반적인 특징은 다음과 같습니다.

1. 조기 세포사멸: 세포막 구조 변화, 포스파티딜세린 역전

2. 초기 및 중기 세포사멸: 세포질 밀도가 증가하고, 미토콘드리아 막전위가 사라지고, 투과성이 변화하며, 시토크롬 C가 세포질로 방출됩니다.

3. 후기 세포사멸: 세포사멸 신호전달;

4. 후기 세포사멸: DNA가 180~200bp 조각 크기로 분해됨.

그림 1: 세포사멸 경로에서 순차적 사건의 발생 및 감지

1. 초기 세포사멸 : Annexin-V/PI 이중염색(세포외막에 PS 검출)

정상적인 살아있는 세포에서 포스파티딜세린(PS)은 세포막의 안쪽에 위치합니다. 세포사멸이 발생하면 세포막이 변화하고 PS는 세포막의 안쪽 표면에서 세포막의 바깥쪽 표면으로 뒤집힙니다. Annexin-V는 분자량이 35-36 KD인 Ca2+ 의존성 인지질 결합 단백질로 PS와 높은 친화력으로 결합할 수 있습니다. 플루오레세인(FITC, Alexa fluor488 등)으로 표지된 Annexin-V를 프로브로 사용하면 유세포 분석기 또는 형광 현미경으로 사멸 세포와 살아있는 세포를 확인할 수 있습니다.

괴사 세포의 PS도 세포막의 안쪽 표면에서 세포막의 바깥쪽 표면으로 전환됩니다. Annexin-V도 괴사 세포 표면의 PS를 인식할 수 있으므로 Annexin-V는 괴사 세포와 세포 사멸 세포를 구별할 수 없습니다. 또한 프로피딘 요오드화물(PI)은 핵산 염료로 세포의 DNA에 결합할 수 있으며 완전한 세포막을 관통할 수 없습니다. 초기 세포 사멸 세포와 살아있는 세포의 세포막은 여전히 ​​손상되지 않았으며 PI 염료는 세포막을 통해 자유롭게 세포로 들어가 DNA와 결합할 수 없으므로 PI 염료는 세포 사멸 세포와 살아있는 세포를 표지할 수 없지만 PI 염료는 괴사 세포의 세포막을 통해 세포의 DNA와 결합할 수 있습니다. 죽은 세포의 PI 염료는 488nm 레이저로 여기된 후 적색 형광을 방출하고 해당 채널에서 수신됩니다. 따라서 Annexin V와 PI를 함께 사용하여 살아있는 세포, 초기 세포 사멸 세포 및 괴사 세포를 구별할 수 있습니다.

그림 2: Annexin-v/pi 이중 염색 후 유세포 분석 결과 분석

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2. 초기 세포사멸: JC-1 염색(미토콘드리아 막전위 변화 검출)

세포사멸 과정은 종종 미토콘드리아 막 전위의 파괴를 동반하는데, 이는 널리 세포사멸 연쇄 반응 과정에서 가장 초기의 사건 중 하나로 여겨진다. 이는 핵 세포사멸의 특성(크로마틴 농도, DNA 파손)이 나타나기 전에 발생한다. 미토콘드리아 막 전위가 붕괴되면 세포사멸은 되돌릴 수 없다. 미토콘드리아 막 전위의 존재는 로다민 123, JC-1, JC-10과 같은 일부 친유성 양이온 형광 염료가 미토콘드리아 기질에 결합할 수 있게 한다. 이들의 형광의 증가 또는 감소는 미토콘드리아 내막의 전기 음성도의 증가 또는 감소를 나타낸다.

JC-1은 미토콘드리아 막 전위 △ΨM을 검출하는 데 널리 사용되며, 미토콘드리아에서 전위 의존적 축적을 보여줍니다. 정상적인 미토콘드리아에서 JC-1은 미토콘드리아 기질에 응집되어 중합체를 형성하여 강한 적색 형광(ex=585 nm, em=590 nm)을 방출합니다. 세포 사멸 세포에서 미토콘드리아 막 전위가 탈분극되고 JC-1은 미토콘드리아에서 방출되어 농도가 감소하고 녹색 형광을 방출하는 단량체 형태로 역전됩니다. 따라서 색상 변화는 미토콘드리아 막 전위의 변화를 직접 반영합니다. 미토콘드리아 탈분극 정도는 적색/녹색 형광 강도의 비율로 측정할 수도 있습니다. JC-1 검출은 일반적인 방법입니다.

3. 후기 세포사멸: TUNEL법(DNA fragment in situ labeling method)

세포사멸의 후기 단계에서 염색체 DNA의 이중 가닥 절단 또는 단일 가닥 절단으로 인해 많은 수의 끈적끈적한 3-OH 말단이 생성됩니다. 데옥시리보뉴클레오타이드 말단 전이효소(TdT)의 작용으로 루시퍼라제 표지된 dUTP가 DNA의 3-말단에 결합되어 세포사멸 세포를 검출할 수 있으며, 이러한 방법을 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 매개 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL)이라고 합니다. 정상 또는 증식하는 세포에는 DNA 절단이 거의 없기 때문에 3-OH 형성이 없고 염색할 수 있는 것이 거의 없습니다. TUNEL은 실제로 분자생물학과 형태학을 결합한 연구 방법입니다. 완전한 단일 세포사멸 핵 또는 세포사멸체의 현장 염색은 세포사멸의 전형적인 생화학적 및 형태적 특성을 정확하게 반영할 수 있습니다. 파라핀 포매 조직 절편, 동결 조직 절편, 배양 세포 및 조직에서 분리된 세포의 세포 형태를 결정하는 데 사용할 수 있으며, 매우 적은 수의 세포 사멸 세포를 검출할 수 있습니다. 따라서 세포 사멸 연구에 널리 사용됩니다.

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