푸로마이신은 스트렙토마이세스 알보니거가 생산하는 아미노글리코사이드 항생제입니다. 아미노아실-tRNA 분자의 3' 말단의 유사체이며 리보솜의 A 부위에 결합하여 확장되는 펩타이드 사슬에 통합되어 리보솜에서 펩타이드 전좌를 방해하고 번역 중에 조기 사슬 종료를 유발하여 단백질 합성을 억제할 수 있습니다.
그림 1 푸로마이신(CAS NO. 53-79-2)의 구조식
puromycin N-acetyltransferase(pac)를 인코딩하는 pac 유전자는 puromycin을 생성하는 박테리아 Streptomyces alboniger에서 발견되어 puromycin에 대한 내성을 부여합니다. 이 특성은 현재 pac 유전자를 가진 플라스미드를 운반하는 포유류의 안정적인 형질 전환 세포주를 스크리닝하는 데 널리 사용됩니다. 안정적인 세포주를 스크리닝하는 데 puromycin이 널리 사용되는 것은 대부분이 상업용 렌티바이러스 벡터에서 pac 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터의 특성과 관련이 있습니다. 특정한 경우에 puromycin은 pac 유전자를 운반하는 플라스미드로 형질 전환된 E. coli 균주를 스크리닝하는 데에도 사용할 수 있습니다. puromycin은 빠르게 작용하여 낮은 농도에서 빠르게 세포 사멸을 일으킬 수 있습니다. 부착 포유류 세포는 2-5µg/mL의 puromycin 농도에 민감한 반면, 현탁 세포는 이미 0.5-2µg/mL의 puromycin 농도에 민감합니다. 푸로마이신에 대한 안정적인 저항성을 가진 포유류 세포는 일주일 안에 생성될 수 있다.
안정된 세포주 스크리닝
실험 원리
외인성 DNA/shRNA를 pac 유전자를 함유하는 벡터에 클로닝함으로써, 재조합 벡터는 숙주 세포에 형질전환되어 염색체에 통합되고, 세포 분열과 함께 안정적으로 전달되며, 최종적으로 퓨로마이신으로 스크리닝된다.
준비 및 사전 실험
1 권장 사용 농도
포유류 세포: 1-10 μg/mL, 최적 농도는 실험 전 단계에서 결정해야 합니다.
E.coli: LB 아가 배지에서 pac 유전자를 지닌 안정된 형질전환 E. coli를 스크리닝하려면 125 μg/mL의 농도를 사용합니다. E. coli 안정 형질전환체의 푸로마이신 스크리닝에는 정확한 pH 조정이 필요합니다.
2 용해 방법
퓨로마이신을 증류수에 녹여 50 mg/mL의 원액을 제조하고, 0.22 μm 필터로 여과 살균한 후, 분취하여 -20°C에 보관한다.
3 푸로마이신 사멸 곡선 결정(shRNA 형질감염 또는 렌티바이러스 형질 도입을 예로 들어)
푸로마이신의 효과적인 스크리닝 농도는 세포 유형, 성장 상태, 세포 밀도, 세포 대사 및 세포 주기 위치와 관련이 있습니다. 형질감염되지 않은 세포를 죽이는 푸로마이신의 최소 농도를 결정하는 것이 중요합니다. 첫 번째 실험에 대한 푸로마이신 기울기 스크리닝 사전 실험을 수행하여 킬 곡선을 확립하는 것이 필수적입니다.
- 24-웰 플레이트에 5~8×10 4 세포/웰의 밀도로 세포를 넣고 밤새 배양합니다.
- 스크리닝 매체를 준비합니다: 퓨로마이신의 다양한 농도(예: 0~15μg/mL, 최소 5단계 구배)를 함유한 신선한 매체를 사용합니다.
- 신선하게 준비한 스크리닝 배지로 교체하고, 배양을 계속하면서 세포 성장을 관찰하고, 2~3일마다 새로운 스크리닝 배지를 교체합니다.
- 매일 세포 생존을 관찰합니다. 4~6일 내에 모든 비감염 세포를 효과적으로 죽이는 약물 농도가 최소 농도입니다.
안정한 형질전환체의 스크리닝
- 48-72시간 동안 렌티바이러스 감염(70-80% 합류) 후, 적절한 농도의 푸로마이신이 포함된 배지에서 최소 48시간 동안 세포를 배양합니다. 푸로마이신이 있는 비형질감염 대조군의 모든 세포가 죽으면, 바이러스 감염군의 나머지 세포는 모두 양성 세포입니다.
【주의】: ① 항생제의 효과는 세포가 활발한 분열 단계에 있을 때 가장 두드러집니다. 세포가 너무 조밀하면 항생제의 효능이 현저히 감소합니다. 세포 밀도는 25%를 초과해서는 안 됩니다. ② 매일 세포 성장 상태를 관찰합니다. 퓨로마이신 스크리닝에는 최소 48시간이 필요하며, 퓨로마이신 스크리닝의 효과적인 농도는 일반적으로 3~10일 동안 지속됩니다. 바이러스의 MOI가 높을수록 각 세포에 포함된 shRNA와 퓨로마이신 내성 유전자의 사본이 많아집니다. 퓨로마이신 스크리닝을 수행할 때 MOI가 높을수록 세포에 포함된 pac 사본이 많아지고 허용할 수 있는 퓨로마이신 농도가 높아집니다. 퓨로마이신 농도를 조정하여 형질감염된 세포를 스크리닝하지만, 퓨로마이신 농도는 킬 곡선의 최소 효과적인 농도보다 낮아서는 안 됩니다.
- 최소 농도의 푸로마이신이 포함된 배양배지를 첨가하여 세포를 증식시키고, qPCR 검사 결과가 합격한 후 동결보존을 진행합니다.
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제품 이름 |
고양이# |
사양 |
모습 |
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푸로마이신 디하이드로클로라이드 CAS:58-58-2 |
60210ES25 |
25mg |
흰색 또는 흰색에 가까운 가루 |
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60210ES60 |
100mg |
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60210ES72 |
250mg |
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60210ES76 |
500mg |
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60210ES80 |
1g(그램) |
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푸로마이신 (용액 10 mg/mL) CAS:58-58-2 |
60209ES10 |
1×1ml |
용액(H 2 O에 10 mg/mL) |
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60209ES50 |
5×1ml |
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60209ES60 |
10×1ml |
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|
60209ES76 |
50×1ml |
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60210ES25/60/72/76/80 |
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