그러나 T4 DNA 리가제는 여전히 실제 적용에서 안정성 저하, 어댑터-어댑터 연결 증가, DNA 라이브러리 수율 저하 등 몇 가지 과제에 직면해 있습니다. 이러한 문제로 인해 실험 효율성이 떨어지고, 데이터 품질이 떨어지고, 실험 결과의 반복성이 떨어지고, 제품 순도가 낮아져 분자 생물학 실험의 전반적인 효과와 시퀀싱 데이터의 정확성에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 Yeasen은 자회사인 Molefuture의 혁신적인 ZymeEditor ^™ 효소 진화 플랫폼을 기반으로 T4 DNA 리가제에서 효소 진화를 수행했습니다.

그림 1 T4 DNA 리가제 반응원리의 개략도 ^[1]

그림 2 T4 DNA 리가제의 구조

합리적 설계 외에도, T4 DNA 리가제의 지시 진화는 안정성, 활성 및 잔류 활성을 스크리닝하여 MTPS 방법으로 수행되었습니다. 그리고 ^104개 이상의 돌연변이 라이브러리가 스크리닝되었습니다. 돌연변이 데이터를 철저히 분석한 후, 유망한 후보를 정제 및 엄격한 테스트를 위해 선택했습니다. 그런 다음 합리적 설계와 지시 진화로 얻은 모든 수상자는 정제 후 자세한 특성화를 거쳤으며, 여기에는 활성, 안정성, 어댑터 자가 결찰, DNA 단편 자가 결찰 및 DNA 수율에 대한 평가가 포함되었습니다. G1 돌연변이를 기반으로 팀은 DNA 셔플링을 수행하고 지시 돌연변이 설계를 결합하여 다양한 응용 프로그램 요구 사항을 충족하는 뛰어난 돌연변이를 얻었습니다.

여러 차례의 시퀀싱 검증을 거쳐 돌연변이 제품에서 시장 제품까지

ZymeEditor ^TM 효소 진화 플랫폼 은 효소 진화 기술을 통해 높은 열 안정성, 높은 라이브러리 수율, 낮은 어댑터 자가 결찰 특성을 지닌 T4 DNA 리가제 돌연변이체를 성공적으로 진화시켰습니다. 현재 개선된 T4 DNA 리가제가 성공적으로 출시되었습니다. Hieff® Versatile T4 DNA Ligase(600 U/μL)(Cat#12996ES). 이 제품은 라이게이션 효율과 열 안정성 측면에서 기존의 야생형 T4 DNA 리가제보다 성능이 뛰어나며, 고처리량 시퀀싱을 통해 검증되어 우수한 품질을 보장합니다.

데이터 프레젠테이션

1. 더 높은 열 안정성

Yeasen의 T4 DNA 리가제 돌연변이체는 42℃에서 0, 2, 4시간 동안 열처리를 거쳤으며 공급업체 Q, N, A, T의 T4 DNA 리가제와 비교되었습니다. 그런 다음, Yeasen DNA 라이브러리 구축 키트(Cat#12927ES)를 사용하여 1µg의 단편화된 소 gDNA를 사용하여 전체 게놈 DNA 라이브러리를 구축하여 T4 DNA 리가제의 열 안정성을 비교했습니다.

그림 3 42℃에서의 열안정성 시험

결과:

열 안정성: Yeasen ≈ 공급업체 N ≈ 공급업체 A > 공급업체 T > 공급업체 Q.

2. 더 높은 도서관 수율

Yeasen의 T4 DNA 리가제 돌연변이체는 Vendor Q, N, A 및 T의 T4 DNA 리가제와 비교하여 높고 낮은 DNA 입력 수준에서 라이브러리 수율을 위해 테스트되었습니다. DNA 라이브러리를 구성하기 위해 1 µg 및 0.5 ng의 단편화된 소 gDNA를 입력하는 Yeasen DNA 라이브러리 구축 키트(Cat#12927ES)가 사용되었습니다.

그림 4 DNA 라이브러리 수율 분석

결과:

라이브러리 수율(1 µg gDNA): Yeasen > 공급업체 Q ≈ 공급업체 T ≈ 공급업체 A > 공급업체 N. 라이브러리 수율(0.5 µg gDNA): Yeasen ≈ 공급업체 Q ≈ 공급업체 A ≈ 공급업체 T > 공급업체 N.

3.하부 어댑터 자가결찰

Yeasen의 T4 DNA 리가제 돌연변이체는 어댑터 자가 결찰을 위해 공급업체 Q, N, A 및 T의 T4 DNA 리가제와 비교되었습니다. Yeasen DNA 라이브러리 구축 키트(Cat#12927ES)를 사용했으며, 0ng 및 0.5ng의 단편화된 소 gDNA를 입력하여 전체 게놈 DNA 라이브러리를 구축했습니다.

그림 5 0 ng(왼쪽) 및 0.5 ng(오른쪽) gDNA 입력을 사용한 어댑터 자가 결찰 데이터

결과:

1) 어댑터 자가 결찰률(0 ng gDNA): 공급업체 N > Yeasen > 공급업체 T > 공급업체 A > 공급업체 Q.

2) 어댑터 자가 결찰 비율(0.5 ng gDNA): Yeasen > 공급업체 T > 공급업체 Q ≈ 공급업체 N > 공급업체 A.

문의하기

Yeasen은 기존 T4 DNA 리가제의 한계를 성공적으로 극복하여 열 안정성, 라이브러리 수율 및 어댑터 자가 결찰에 뛰어난 T4 DNA 리가제 제품을 제공합니다. 이 과정에서 회사는 풍부한 돌연변이 라이브러리를 축적하여 연구자에게 다양한 실험적 요구를 충족하는 다양한 옵션을 제공했습니다. 당사의 제품이나 T4 DNA 리가제 돌연변이에 관심이 있으시면 다음 방법을 통해 언제든지 문의해 주십시오.

이메일: order1@yeasen.com (미국)

전화: +1 240-472-6069(미국)

또한 Yeasen은 다양한 T4 DNA 리가제 제품 시리즈를 제공합니다. 제품 링크를 클릭하여 제품 정보를 문의하세요.

참고문헌

[1] Shuman S.DNA 리가제: 진행 상황 및 전망 [J] .생화학 저널, 2009, 284(26):17365-17369.