RNase HII, 또는 RNase H2라고도 알려진 엔도리보뉴클레아제는 이중 가닥 DNA 나선 내에 자리 잡은 고립된 리보뉴클레오타이드의 5' 말단에 있는 인산디에스테르 결합을 특이적으로 표적으로 삼아 절단하여 5' 인산기와 3' 하이드록실기를 생성합니다(그림 1). 이 효소는 단일 가닥 RNA에 대한 최소한의 절단 활성을 나타내며 이중 가닥 DNA(dsDNA)와 단일 가닥 DNA(ssDNA)에 대해 모두 불활성입니다. 50°C~75°C의 온도 범위에서 기능적으로 활성인 RNase HII는 70°C~75°C의 온도에서 최고 성능에 도달합니다. dsDNA나 ssDNA에 영향을 미치지 않고 리보뉴클레오타이드가 통합된 DNA 부위에서 표적화된 단일 부위 절단을 수행하는 고유한 능력을 활용하여 RNase HII는 프라이머 활성화 및 연장을 포함한 반응 개시를 위한 정밀 "트리거" 역할을 하여 특정 증폭을 달성합니다. 이 효소는 RNase H-dependent PCR(rhPCR), 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 기술 및 오카자키 단편의 RNA 구성 요소 분해에서 핵심적인 역할을 합니다.

一. RNase H 의존 PCR ( rhPCR )
rhPCR은 RNase HII와 특별히 설계된 폐쇄형 절단 가능 rhPCR 프라이머를 PCR 프로세스에 통합합니다. 이 접근 방식은 RNase HII의 고유한 특성을 활용하여 DNA-RNA 하이브리드 내의 RNA를 선택적으로 가수분해하는 동시에 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA와 RNA의 인산이에스테르 결합을 그대로 둡니다. 결과적으로 RNase HII는 DNA-RNA 하이브리드만 소화하고 프라이머가 표적 DNA 서열과 완벽하게 상보적일 때 프라이머 연장을 허용합니다. 이 표적 작용은 반응의 정확도를 크게 향상시킵니다. RNase HII는 리보핵산의 5' 말단에서 절단하여 돌연변이를 유도하지 않고 리보뉴클레오티드의 정확한 제거를 시작할 수 있는 유일한 효소입니다. 높은 특이성, 민감성 및 재현성으로 인해 rhPCR은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 감지, 유전자 타이핑, 여러 표적의 동시 감지 및 환경 핵산 분석과 같은 응용 분야에서 뚜렷한 이점을 제공합니다.

기술 경로

1. 프라이머 디자인

프라이머 설계는 절단 후 용융 온도가 어닐링 온도보다 높아서 프라이머가 PCR 사이클 동안 템플릿에 안정적으로 결합되도록 해야 합니다. rhPCR 프라이머는 세 부분으로 구성됩니다.

1) 5' DNA 세그먼트: 표준 PCR 프라이머와 길이와 녹는점(Tm) 요구 사항이 비슷하여 RNase HII 효소로 절단된 후 템플릿 DNA와 효과적으로 짝을 이루고 확장될 수 있습니다.

2）단일 RNA 염기: RNase HII에 대한 절단 부위를 제공합니다.

3) 3' DNA 세그먼트: 일반적으로 프로필렌 글리콜과 같은 짧고 확장 불가능한 분자인 차단제가 포함된 4~5개 염기 길이로, 차단제가 제거될 때까지 DNA 중합효소의 확장을 방지합니다.

2. 절단 및 연장

rhPCR 반응의 시작에서 프라이머와 템플릿 DNA는 자유롭다. 프라이머가 특정 RNA:DNA 헤테로듀플렉스 템플릿에 결합하면 차단된 프라이머의 RNA 염기 5'-측이 인식되고 RNase HII 효소에 의해 절단되어 3'-하이드록실기가 있는 DNA 올리고뉴클레오타이드가 남게 되어 DNA 중합효소가 확장할 수 있는 시작점을 제공한다. 그 다음에는 통상적인 PCR 증폭 과정이 이어진다.

그림 2. rhPCR 원리의 다이어그램 ^[1]

二. 루프 매개 등온 증폭(LAMP)

루프 매개 등온 증폭(LAMP)은 짧은 시간 내에 등온 조건에서 핵산을 증폭할 수 있는 간단하고 빠른 유전자 증폭 방법입니다. 그러나 실온에서 준비하는 동안 DNA 중합효소 활동이 시작되기 때문에 비특이적 불일치가 형성되어 소량의 오페어와 프라이머 다이머가 발생하여 사소한 오염이 발생하여 거짓 양성이 발생할 수 있습니다.
RNase HII를 LAMP 증폭 시스템에 적용하면 LAMP 기술에서 거짓 양성의 문제를 효과적으로 해결하여 임상 진단에 적용 범위를 넓힐 수 있습니다. 그림 3에서 보듯이 RNase HII를 사용하는 프라이머 활성화 LAMP 방법(PA-LAMP)은 프라이머가 표적 ssDNA와 짝을 이룰 때 RNase HII 효소가 프라이머의 RNA를 특이적으로 절단하여 활성화하고 프라이머 확장을 허용하여 특정 증폭을 달성하고 시스템에서 거짓 양성을 효과적으로 줄입니다.

예센 RNase HII

YEASEN의 RNase HII (Cat#14539) 는 펜실베이니아주 Pyrococcus abyssi 에서 유래되었으며 오염성 핵산 분해 효소, 틈 효소 및 RNase 잔류물이 없고 호스트 DNA 오염이 적어 시스템에서 거짓 양성 반응을 효과적으로 줄입니다. YEASEN의 RNase HII는 내열성이 매우 뛰어나 95°C에서 30분 후에도 활성을 유지하므로 다양한 rhPCR 반응 시스템과 호환되며 LAMP 및 기타 응용 분야에도 적합합니다.

1. 대장균 게놈 DNA 잔류물 < 0.5개 사본/100 U

다양한 배치의 RNase HII에서 E. coli 유전체 DNA 잔류물을 검출한 결과, YEASEN의 RNase HII의 숙주 유전체 DNA 잔류물이 0.5개 사본/100 U보다 훨씬 낮음을 보여주었습니다.

그림 4. 대장균 게놈 DNA 잔류물 검출

2. 95°C 내열성 시험

RNase HII를 95°C에서 0~45분간 가열한 후 RNase HII의 효소 활성을 테스트했습니다. 그 결과 YEASEN의 RNase HII는 45분간 가열한 후에도 효소 활성이 거의 손실되지 않았습니다.

그림 5. 95℃ 내열성 시험

3. 엑소뉴클레아제, 니킹 효소 또는 RNase 잔류물 없음(1 U 용량)

다양한 기질 DNA/RNA에 1U의 RNase HII 배치를 넣고 37°C에서 4시간 동안 아가로스 겔 전기영동을 실시한 결과, RNase HII에 엑소뉴클레아제, 닉킹 효소 또는 RNase 잔류물이 없음을 확인했습니다.

그림 6. 엑소뉴클레아제, 닉킹효소, RNase 잔류물 검출 결과

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참고문헌

[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. RNase H-의존 PCR(rhPCR): 차단된 절단 가능 프라이머를 사용한 향상된 특이성 및 단일 뉴클레오티드 다형성 검출. BMC Biotechnol. 2011년 8월 10일;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.

[2] Du WF, Ge JH, Li JJ, et al. 프라이머 활성화 루프 매개 등온 증폭(PA-LAMP)을 통한 단일 뉴클레오티드 돌연변이의 단일 단계, 고특이성 검출[J]. Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050. DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.