"올라운더" DNase I에 대해 얼마나 알고 계신가요?

데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I) 은 단일 가닥(ssDNA)과 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 모두 소화할 수 있는 비특이적 엔도뉴클레아제입니다. 인산디에스테르 결합을 가수분해하여 5'-인산기와 3'-OH기가 있는 모노-데옥시뉴클레오타이드와 올리고-데옥시뉴클레오타이드를 생성합니다. DNase I 활성의 최적 pH 범위는 7-8이며 활성은 Ca 2+ 에 따라 달라지며 Mn 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ 등과 같은 2가 금속 이온에 의해 활성화될 수 있습니다. Mg 2+ 가 존재할 경우 DNase I은 임의의 부위에서 이중 가닥 DNA를 무작위로 절단합니다. Mn 2+ 가 존재할 경우 DNase I은 동일한 부위에서 이중 가닥 DNA를 절단하여 1-2개의 뉴클레오타이드가 돌출된 평활 말단 또는 응집 말단을 생성합니다.

그림 1. Mg 2+ 및 Mn 2+ 존재 하에서 dsDNA를 절단하는 DNase I의 개략도

일반 DNase I은 주로 소 췌장에서 정제되거나 재조합 효소입니다. 소 췌장에서 정제된 DNase I과 비교했을 때, 재조합 DNase I은 상대적으로 내인성 RNase 수치가 낮거나 RNase가 없는 제품으로 제형화될 수 있어 RNA 샘플에서 DNA를 제거하는 것과 같은 RNase에 민감한 응용 분야에 더 적합합니다.

응용 프로그램

응용 분야와 관련하여 DNase I은 RNA 무결성을 유지하는 것과 관련된 실험, 예를 들어 DNA가 없는 RNA 추출, 역전사 전 gDNA가 없는 RNA 템플릿 준비, 시험관 내 전사 후 DNA 템플릿 분해에 사용되는 것으로 잘 알려져 있습니다. 또한 rRNA 제거 시 DNA 프로브 소화, 닉 번역을 통한 DNA 표지, 풋프린팅 방법을 사용한 DNA-단백질 상호 작용 분석, 무작위 DNA 라이브러리 생성, 세포 용해물 또는 단백질 추출물의 점도 감소, 세포 배양에서 첨가제로 세포 접착 소화, TUNEL 분석에서 양성 대조군으로 게놈 DNA 부분 절단에 사용할 수 있습니다. 요약하면 DNase I은 DNA의 효소 소화가 필요한 거의 모든 응용 분야에서 사용할 수 있습니다. 아래에서 몇 가지 일반적인 응용 분야에 대한 간략한 소개를 제공합니다.

  • RNA 추출 또는 역전사 전 gDNA 제거

실험실에서 일반적으로 연구되는 샘플인 RNA는 자체 품질로 인해 실험 데이터의 품질에 큰 영향을 미칩니다. 일반적으로 RNA 추출 과정에서 gDNA의 잔류물을 완전히 피하는 것은 불가능합니다. 따라서 어려운 다운스트림 애플리케이션(예: mRNA 발현 분석, 전사체 분석 등)을 수행하기 전에 일반적으로 RNA 샘플을 DNase I로 처리하여 잔류 gDNA를 소화하는 것이 좋습니다. gDNA 소화는 RNA 추출 중, RNA 추출 후 또는 RNA 역전사 전에 수행할 수 있습니다.

그림 2. DNase I 기반 gDNA 제거 프로세스

  • 시험관 내 전사에서 템플릿 DNA 제거

시험관 내 전사(IVT)는 주로 DNA를 템플릿으로 사용하여 적절한 기질과 완충액의 영향 하에 RNA를 생성합니다. 이 과정에서 일반적으로 사용되는 RNA 중합효소에는 RNA 합성을 촉진하는 T7, T3 및 SP6이 포함됩니다. 그러나 합성된 RNA 생성물에는 DNA 잔류물이 포함될 수 있으며 이러한 잔류물을 제거하는 것은 다운스트림 실험에 유익합니다.

특히 mRNA 백신 개발 과정에서 이러한 DNA 잔류물을 제거하는 것은 후속 정제 과정의 어려움과 최종 제품의 순도에 직접적인 영향을 미치는 중요한 단계입니다. 템플릿 DNA를 효율적으로 제거하기 위해 일반적으로 DNase I을 처리에 사용하여 RNA 샘플에 DNA 잔류물이 없도록 보장하는데, 이 단계는 실험의 전반적인 정확도와 효율성을 개선하는 데 도움이 됩니다.

그림 3: 선형화된 플라스미드를 템플릿으로 사용한 시험관 내 전사 과정 [4]

  • RNA 라이브러리 구축 및 시퀀싱에서의 rRNA 제거

생물체에서 rRNA는 매우 풍부하고 보존성이 높아 생물학적 정보 연구를 얻는 데는 거의 의미가 없습니다. 그러나 실험 중 추출된 총 RNA의 95%는 인간 rRNA이며 이러한 rRNA의 존재는 표적 RNA의 검출을 방해할 수 있습니다. 따라서 RNA 라이브러리 제조 및 시퀀싱에서는 일반적으로 rRNA를 먼저 제거합니다. 현재 rRNA 제거의 주요 방법은 RNAase 소화이며 주요 작동 단계 및 원리는 다음과 같습니다.

  1. 전체 RNA 추출;
  2. 단일 가닥 DNA 프로브를 rRNA 분자와 교잡시킵니다(참고: rRNA에 특화된 단일 가닥 DNA 프로브를 설계하고 합성합니다)
  3. RNase H는 교잡된 rRNA를 분해합니다.
  4. DNase I은 DNA 프로브를 분해합니다.
  5. rRNA가 성공적으로 제거되고, rRNA가 아닌 RNA 템플릿이 남습니다.

그림 4: 효소적 방법에 기초한 rRNA 제거 원리의 개략도 [5]

  • DNA 라벨링을 위한 Nick 번역

Nick 번역은 실험실에서 데옥시리보핵산 프로브를 표지하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 이 방법은 DNase I과 E.coli DNA Polymerase I의 결합 작용을 통해 달성됩니다.

주요 원칙은 다음과 같습니다.

  1. 먼저, 적절한 농도의 DNase I을 사용하여 표지할 이중 가닥 DNA의 각 가닥에 여러 개의 단일 가닥 틈을 만들고 틈 부위에 3' 하이드록실 말단을 형성합니다.
  2. 그런 다음, 대장균 DNA 중합효소 I의 5'→3' 에그조뉴클레아제 활성을 사용하여 틈의 5' 말단에서 뉴클레오티드를 제거하는 반면, 대장균 의 5'→3' 중합효소 활성을 사용하여 틈의 5' 말단에서 뉴클레오티드를 제거합니다. coli DNA Polymerase I은 틈의 3' 끝에 표지된 뉴클레오타이드를 도입하여 복구합니다. 틈이 DNA 가닥을 따라 이동함에 따라 표지된 뉴클레오타이드는 새로 합성된 DNA 가닥에 통합됩니다.

그림 5: nick translation에 의한 DNA 표지 원리의 개략도 [6]

  • DNase I 풋프린팅 분석 실험

DNase I 풋프린팅 분석은 DNA 분자에서 DNA 결합 단백질의 결합 부위를 식별하는 정밀한 방법입니다. 원리는 DNA 단편에 결합된 단백질이 결합된 영역이 DNase I에 의해 분해되는 것을 보호한다는 것입니다. 효소 소화 후, 남은 단편("풋프린트")을 사용하여 시퀀스를 결정할 수 있습니다. 젤 이미지에는 단백질이 결합된 영역에 해당하는 밴드가 없습니다.

주요 원칙은 다음과 같습니다.

  1. 검사할 이중가닥 DNA 분자의 단일가닥 말단에 라벨을 붙입니다.
  2. 단백질을 DNA와 섞고 효소 소화를 위해 적절한 양의 DNase I을 첨가하여 다양한 길이의 DNA 단편을 형성합니다. 효소의 양은 인접한 DNA 단편이 단 하나의 뉴클레오티드만 차이가 나도록 조절해야 하며, 단백질을 첨가하지 않은 대조군을 병행하여 포함해야 합니다.
  3. DNA에서 단백질을 제거하고, PAGE 전기영동으로 변성된 DNA를 분리한 후, 자가방사선촬영을 통해 발자국 영역의 뉴클레오타이드 서열을 대조군과 비교하여 해석합니다.

그림 6: DNase I Footprinting 분석 원리의 개략도 [7]

Yeasen의 DNase I 선택 가이드

다양한 응용 분야 요구 사항을 충족하기 위해 Yeasen은 E. coli 에서 재조합 DNase I을 제공하며 mRNA 시험관 내 전사 및 기타 응용 분야의 요구 사항을 충족하는 GMP 등급 DNase I을 제공할 수 있습니다.

제품 포지셔닝

애플리케이션

제품 이름

카탈로그 번호

RNase 프리

RNA 및 단백질 제제에서 DNA 제거

재조합 DNase I (RNase-free)

10325ES

GMP 등급, RNase Free

mRNA의 시험관 내 전사

UCF.ME® 디옥시리보뉴클레아제 I (DNase I) GMP 등급

10611ES

참고문헌

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. 두경부 암에서의 HPV DNA, E6/E7 mRNA 및 p16INK4a 검출: 체계적 고찰 및 메타분석[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. 자궁경부 샘플에서 발암성 HPV 유형별 바이러스 DNA 부하와 E6/E7 mRNA 검출 비교: 다기관 연구 결과[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky LS. 정량 RNA-PCR에 사용하기 위한 RNA에서 오염 DNA를 제거하는 Dnase I 최적화[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. 임상에서의 번역을 가능하게 하는 시험관 내 전사 mRNA(IVT mRNA)의 발전[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. RNA 분해 없이 DNase I의 비가역적 열 불활성화[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. 바이오틴 표지 d-UTP[J]를 사용한 중기 염색체의 현장 닉 번역. 인간 유전학, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. 미생물 게놈의 복제 기원을 식별하기 위한 적합한 방법 선택. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.

 

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