당단백체학과 항체 약물 연구의 급속한 발전으로 당화 변형도 많은 주목을 받았습니다. 세포와 세포, 세포와 병원체 간의 접촉은 주로 당과 단백질의 상호작용을 통해 완료되고 당화는 당접합체의 접착 특성을 결정합니다. IgG에서 Fc 영역의 Asn297에서 보존된 N-연결 당화도 활성에 중요합니다. 또한 일부 항체에는 추가 N-글리칸이 있으며, 이는 Fc 영역의 Asn297에서 보존된 부위와 함께 항체의 인식, 반감기 및 면역 반응에 영향을 미칩니다.
단백질 글리코실화는 단백질의 특정 부위에서 글리칸 사슬의 연결을 포함하는 복잡한 번역 후 변형입니다. 글리칸 사슬의 유형에 따라 당단백질은 N-연결 글리코단백질, O-연결 글리코단백질 등으로 나뉩니다. 게다가 단백질 글리코실화는 숙주 세포 유형과 발효 조건(배양 배지, pH 값, 온도 등)의 영향을 받습니다. 따라서 당단백질은 일반적으로 글리코실화 부위, 글리코실화 수준 및 글리칸 사슬의 특정 구조를 포함하여 글리코실화 패턴에 이질성이 있어 글리칸 사슬 분석 및 구조적 특성화 작업이 매우 어렵습니다. 글리칸 사슬 구조 정보를 최대한 얻기 위해 글리칸 사슬 분석의 주요 전략은 먼저 단백질에서 글리칸 사슬을 방출한 다음 자세한 분석 및 특성화를 수행하는 것입니다. 이 전략에서 효율적이고 정확하며 안정적인 탈글리코실화 방법이 중요합니다.
현재 탈글리코실화에는 효소적 방법이 널리 사용되고 있습니다.
당단백질은 글리칸 사슬의 유형에 따라 N-연결 및 O-연결 글리코펩타이드로 분류할 수 있습니다. N-연결 글리코펩타이드의 경우 일반적으로 사용되는 효소에는 펩타이드 N-글리코시다제 F(PNGase F), 엔도글리코시다제 H(Endo H) 및 엔도글리코시다제 S(Endo S)가 있습니다. PNGase F는 GlcNAc-Asn 결합을 가수분해하고 고만노스, 복합 및 하이브리드 글리칸 사슬을 제거할 수 있습니다. Endo H는 N-글리칸 사슬 펜타사카라이드 코어 내의 글리코시드 결합을 절단합니다. Endo S는 특히 네이티브 IgG의 중쇄의 키토비오스 코어에서 N-연결 글리칸을 절단합니다.
그림 1. PNGase F, Endo H 및 Endo S의 절단 부위.
그중 PNGase F는 당단백질에서 거의 모든 N-연결 올리고당을 제거하는 가장 효과적인 효소 방법으로, 아스파라긴으로 연결된 고만노스, 하이브리드 및 복합 올리고당 당단백질을 절단하여 특히 N-연결 글리칸을 제거할 수 있습니다. 절단 부위는: 가장 안쪽 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)과 아스파라긴 잔기 사이의 아미드 결합이며, 효소 가수분해 후 단백질의 아스파라긴을 아스파르트산으로 전환합니다.
α1-6 푸코스가 GlcNAc 코어에 위치하는 경우 PNGase F도 절단할 수 있습니다. 오직 α1-3 푸코스가 GlcNAc 코어(식물과 곤충의 당단백질에서 흔히 발견됨)에 위치하는 경우에만 PNGase F가 절단할 수 없습니다.
그러나 기존의 PNGase F 효소 반응은 항체 N-글리칸을 방출하는 데 몇 시간이 걸리고, 글리칸 방출을 선호하기 때문에 불완전한 탈글리코실화로 인해 편향된 결과가 발생할 수 있으며, 얻은 글리칸 분포가 치료용 항체의 올바른 구성을 나타내지 않을 수 있습니다. 따라서 항체 및 항체 융합 단백질 및 기타 생물 치료제의 생산 과정에서 글리코실화 모니터링을 위해 가능한 한 빨리 정확한 N-글리칸 프로파일을 얻는 것이 중요합니다.
빠른 PNGase F
Fast PNGase F는 몇 분 안에 항체, 면역글로불린, 융합 단백질 및 기타 당단백질을 빠르고 완벽하게 탈글리코실화할 수 있는 최적화된 재조합 시약입니다. 이 효소는 모든 N-글리칸을 빠르고 선호도 없이 제거할 수 있으며 다운스트림 크로마토그래피 또는 질량 분석에 직접 사용할 수 있습니다.
제품 특징:
빠름: 몇 분 안에 완전하고 빠르게 탈당화가 이루어집니다.
높은 순도: 프로테아제, 글리코시다아제 오염 없음, 순도 ≥95%.
비선택적: 선호도 없이 빠르게 모든 N-글리칸을 제거합니다.
우수한 호환성: 다운스트림 크로마토그래피나 질량 분석에 직접 사용됩니다.
테스트 데이터:
1단계 단백질 탈당화:
- 기질 10ug/항체 100ug과 ddH2O를 혼합하여 총 부피를 16uL로 만듭니다.
- Fast PNGase F 완충액(5x) 4 μL를 첨가하고 최종 용량은 20 uL입니다.
- Fast PNGase F를 1 μL 첨가합니다.
- 50°C에서 10분간 배양합니다.
그림 2. 단백질 기질(A)과 항체(B)에 대한 단계적 효소 절단 효과.
1: 단백질 마커Cat#20350ES) 2: 경쟁자 + 기질 또는 항체 3: 경쟁자 + 기질 또는 항체 4:
2단계 단백질 탈당화:
- 기질 10ug/항체 100ug과 ddH2O를 혼합하여 총 부피를 16uL로 만듭니다.
- Fast PNGase F 완충액(5x) 4 μL를 첨가하고 최종 용량은 20 uL입니다.
- 80°C에서 2분간 배양한 후 실온으로 식힙니다.
- Fast PNGase F를 1 μL 첨가합니다.
- 50°C에서 10분간 배양합니다.
그림 3. 단백질 기질(A)과 항체(B)에 대한 2단계 효소 절단 효과.
1: 단백질 마커Cat#20350ES) 2: 경쟁자 + 기질 또는 항체 3: 경쟁자 + 기질 또는 항체 4:
결론:
-
Yeasen Fast PNGase F는 동일한 반응 조건에서 수입 경쟁 제품과 동일하거나 더 높은 효소 절단 효율을 나타냅니다. - 더 높은 효소 절단 효율을 보장하기 위해 2단계 효소 절단을 수행하는 것이 좋습니다. 일부 항체(예: Fab N-글리코실화)에는 예열 단계가 필요합니다.
효율적인 탈당화를 위해.
이외에도
구매 가이드
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제품 번호 |
20406ES |
20407ES |
20414ES |
20413ES |
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제품 이름 |
빠른 PNGase F |
PNGase F |
엔도 H |
엔도 S |
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원천 |
효모 재조합 발현 |
효모 재조합 발현 |
효모 재조합 발현 |
대장균 재조합 발현 |
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특정 활동 |
적용 불가 |
100000유/ml |
1000000유/mL |
8000유로/mg |
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분열 부위 |
거의 모든 N-연결 글리칸 |
거의 모든 N-연결 글리칸 |
N-연결 고마노스 글리칸 |
IgG 중쇄의 핵심 이당류 구조 내에서 절단 |
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소화 시간 |
10분 |
1-3시간 |
1-3시간 |
1시간 |
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글리코실화 |
적합한 |
적합한 |
적합한 |
적합한 |
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단백질 구조 |
적합한 |
적합한 |
적합한 |
적합한 |
주문 정보
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제품 이름 |
제품 번호 |
사양 |
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20406ES20/50 |
20톤/50톤 |
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20407ES01/02 |
15000유/75000유 |
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20414ES92/97 |
10000유/50000유 |
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20413ES80/90 |
1000U/5 x 1000U |