TelN 텔로머라제: DNA 효소 합성의 새로운 동력

생물학에서 텔로미어와 프로텔로머라제에 대해 말할 때, 사람들은 종종 먼저 노화를 떠올립니다. 노화는 피할 수 없는 자연 현상입니다. 텔로미어는 진핵 염색체의 끝에 있는 반복적인 DNA 서열로, 염색체의 무결성을 유지하고 세포 분열 주기를 조절하는 역할을 합니다.

프로텔로머라제는 텔로미어를 연장하는 역전사 DNA 합성 효소입니다. RNA와 단백질로 구성된 핵단백질입니다. 단백질 성분은 RNA 성분과 함께 텔로미어 반복 서열의 합성을 촉진할 수 있습니다.

그림 1. Protelomerase를 통한 텔로미어 확장 기전 [1]

프로텔로머라제는 텔로미어를 복구하고 길게 만들고, DNA 복제의 결함을 보완하고, 세포 분열 중 텔로미어 손실을 막고, 세포 분열 횟수를 늘릴 수 있습니다. 2009년 노벨 생리학·의학상은 엘리자베스 H 블랙번, 캐럴 W 그라이더, 잭 W 쇼스탁에게 세포 기능과 노화에서 텔로미어와 프로텔로머라제의 중요한 역할을 밝혀낸 공로로 수여되었습니다.

오늘은 독특한 Protelomerase인 TelN proProtelomerase를 소개하고자 합니다. TelN Protelomerase는 박테리오파지 N15에서 유래하며 N15 복제 시스템의 구성 요소로 선형 프로파지 DNA 생성에 참여합니다. 진핵생물의 Protelomerase와 달리 TelN은 RNA 구성 요소가 없는 순수한 단백질 효소입니다. 절단-결찰 활성이 있으며 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 절단한 후 절단 부위에 공유적으로 닫힌 끝을 남깁니다.

그림 2. TelN 프로텔로머라제 절단 부위

TelN 프로텔로머라 제 작용 기전

TelN Protelomerase의 인식 부위는 56bp 길이의 팰린드롬 서열이며, 양쪽에 telR과 telL이 있습니다. 타겟 서열의 중앙 위치도 팰린드롬 서열 telO입니다. TelN Protelomerase는 telO 서열 내에서 절단하고 두 절단 끝에서 공유 결합으로 닫힌 헤어핀 구조를 형성합니다. 소화 후 DNA의 끝은 여전히 ​​telR과 telL로 구성되어 있으며, 이를 doggybone DNA(dbDNA)라고 합니다.

그림 3. TelN 부위에서의 프로텔로머라제 절단 메커니즘 [2]

TelN Protelomerase의 특수 효소 절단-결찰 활성으로 인해 원형 플라스미드 DNA는 1단계 효소 반응을 통해 선형 공유 결합 폐쇄 덤벨 모양 분자로 전환될 수 있습니다. 선형 개방 DNA 분자와 비교하여 선형 폐쇄 DNA는 세포에서 단백질 발현 수준이 더 높아 안정성이 높고 이물질 서열이 최소인 선형 폐쇄형 미니 DNA를 구성하는 데 매우 적합합니다. 플라스미드 DNA는 mRNA 백신, DNA 백신 및 세포 유전자 치료의 핵심 요소로서 중요한 역할을 합니다. 기존 플라스미드 생산 방법에는 대장균 발효와 다단계 증폭이 포함되며 발효 과정에서 통제할 수 없는 위험으로 인해 고품질 플라스미드의 수율이 제한되어 백신 생산 능력을 제한하는 핵심이 됩니다. 영국의 Touchlight 회사는 혁신적인 dbDNA 기술을 출시했습니다. 이 기술은 플라스미드 DNA 제조를 위한 기존 박테리아 발효 방법을 방해하고 시험관 내 효소적 DNA 합성을 사용하는 대신 사용합니다. TelN Protelomerase의 특수 효소 절단-결찰 활동은 또한 위 방법에서 선형 폐쇄형 미니 DNA를 생성하는 데 사용됩니다.

DNA 효소 합성에 있어서 TelN Protelomerase의 응용

phi29 DNA 중합효소와 TelN Protelomerase를 기반으로 한 DNA 시험관 내 효소 방법은 생물학적 발효 과정에서 통제할 수 없는 많은 위험을 피할 수 있으며, 시험관 내 효소 방법은 빠른 속도와 높은 수율로 DNA를 합성할 수 있습니다. 합성된 DNA는 mRNA 백신, DNA 백신, 유전자 치료 벡터 및 유전자 편집과 같은 많은 신흥 기술에 사용될 수 있습니다.

그림 4. DNA 효소 합성의 흐름도 [3]

효소적 DNA 합성 과정

  1. 템플릿 변성

원형 플라스미드 DNA 템플릿은 변성 과정을 통해 두 개의 단일 가닥 원형 DNA로 변환됩니다.

  1. 롤링서클 증폭

Phi29 DNA 중합효소와 단일 가닥 원형 DNA를 사용하여 롤링 서클 증폭을 수행하여 프로텔로머라제 인식 서열 간격을 가진 긴 선형 이중 가닥 연쇄 DNA를 생성했습니다.

  1. 절단 및 공유 폐쇄

TelN 프로텔로머라제는 텔로미어 복합체 DNA의 telRL을 인식하고 절단-결찰 활동을 수행하여 공유 결합된 선형 DNA 단량체를 생성합니다.

  1. 박테리아 백본 DNA 제거

제한 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제는 박테리아 골격 DNA를 분해하여 끝에 개방 구조가 있는 DNA를 얻어 표적 유전자 발현 요소만 포함하는 DNA를 얻습니다. DNA 기술의 효소 합성은 생물학적 발효를 우회하고 GMP 수준의 플라스미드 DNA 합성을 빠르게 달성하여 유전자 치료 및 mRNA 백신 분야의 생산 능력 한계를 해결할 수 있습니다. 산업화에 대한 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. DNA 효소 합성 기술의 개발을 촉진하기 위해 YEASEN Biology는 phi29 DNA polymerase(14404ES) 및 TelN Protelomerase(14540ES)와 같은 DNA 효소 합성을 위한 핵심 효소 물질을 제공하여 DNA 효소 합성 기술의 연구 및 생산을 지원할 수 있습니다.

YEASEN의 TelN Protelomerase 성능 발표

  1. 절단-결찰 성능이 매우 뛰어나며, 이는 수입 브랜드와 동등 수준입니다.

TelN Protelomerase 인식 부위를 템플릿으로 포함하는 초나선 플라스미드를 사용하여 YEASEN과 브랜드 A의 그래디언트 첨가(0.078-5 U) 효소를 첨가했습니다. 초나선 플라스미드 0.5 μg을 닫힌 선형 이중 가닥 DNA(dsDNA)로 전환했습니다. 젤 전기영동을 사용하여 전환 효율을 감지한 결과 YEASEN의 TelN Protelomerase의 절단 및 연결 활성이 브랜드 A와 동일하다는 결과가 나왔습니다.

그림 5. TelN M:Marker, C: supercoiled plasmid control의 Protelomerase 절단 활성 검출

  1. 선형 dsDNA의 폐쇄 무결성 > 90%

TelN Protelomerase 인식 부위를 포함하는 초나선 플라스미드를 템플릿으로 사용하고, YEASEN의 TelN Protelomerase와 브랜드 A를 첨가하고, 0.5μg의 초나선 플라스미드를 닫힌 선형 dsDNA로 전환하고, T5 엑소뉴클레아제를 첨가하여 밴드 분해 정도를 통해 말단 무결성을 검출했습니다. 그 결과 YEASEN의 TleN Protelomerase가 생성한 dsDNA 말단 폐쇄 무결성이 >90%로 브랜드 A와 동일했습니다.

그림 6. TelN Protelomerase 종결 폐쇄 무결성 테스트. C1: TelN 인식 부위를 포함하는 플라스미드, TelN Protelomerase 없음; C2: TelN 인식 부위를 포함하는 플라스미드, TelN Protelomerase, T5 엑소뉴클레아제 없음; 플라스미드: TelN 인식 부위를 포함하는 플라스미드.

DNA 효소 합성 관련 제품

제품 분류

제품 이름

카탈로그 번호

프로텔로머라제

TelN 프로텔로머라제(5 U/μL)

14540ES

파이29 DNA 중합효소

phi29 DNA 중합효소(10 U/μL)

14404ES

엑소뉴클레아제

엑소뉴클레아제 III

14525ES

T5 에그조뉴클레아제(10 U/µL)

14538ES

dNTP

dNTP 혼합물(각각 25 mM)

10125ES

참조​

[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. 텔로미어와 프로텔로머라제 생물학. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.

[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. 원핵생물의 분열-결합 효소 TelN에 의해 ​​생성된 선형 폐쇄 미니 DNA는 포유류 세포에서 기능합니다. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.

[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. 원핵생물의 분열-결합 효소 TelN에 의해 ​​생성된 선형 폐쇄 미니 DNA는 포유류 세포에서 기능합니다. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.

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