- 배경
이 보고서에 요약된 데이터는 MycAway TM Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit (2G) 제품에 대해
요약 데이터는 사용자의 참조용일 뿐이며, 사용자는 자신의 샘플을 사용하여 마이코플라스마 방법을 검증하여 해당 방법이 사용자의 요구 사항을 충족하는지 확인해야 합니다. 이 키트를 사용하는 모든 실험실은 다음 매개변수를 검증하는 것이 좋습니다. 검출 한계, 특이성 및 견고성.
검증 내용：
|
성능 |
검증 매개변수 |
검증 결과 |
|
검출 한계 |
마이코플라스마 균주 검출 한계 |
약전 마이코플라스마 10종에 대한 검출한계: 10 CFU/mL, 각각 24회 검사, 검출률 ≥95%. |
|
특성 |
샘플 매트릭스 간섭 |
9가지 다른 샘플 매트릭스와 DNA 희석 용액을 테스트한 결과, 마이코플라스마가 검출되지 않았습니다. |
|
교차 반응성 |
생물제약 분야에서 흔히 사용되는 14가지 균주와 6가지 엔지니어링 세포를 테스트한 결과, 마이코플라스마가 검출되지 않았습니다. |
|
|
내구성 |
동결-해동 안정성 |
키트 성능에 영향을 주지 않고 20번의 반복적인 동결-해동 사이클을 견딜 수 있습니다. |
|
열 가속 안정성 |
37°C에서 14일간, 4°C에서 30일간은 영향을 받지 않았습니다. |
|
|
기기 호환성 |
ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 및 Roche LightCycler®480와 호환됩니다. |
|
|
적용 범위 |
마이코플라스마 DNA 유형의 적용 범위 |
마이코플라스마 16S rRNA 시퀀스를 사용한 데이터베이스 비교는 몰리쿠테스계에 속하는 183개 종을 포괄합니다. |
- 실험재료 및 방법
2.1 MycAway TM 마이코플라스마 실시간 qPCR 검출 키트(2G), 공급업체:
2.2 MolPure TM 자기 잔류 DNA 샘플 준비 키트, 공급업체:
2.3 마이코플라스마 감수성 표준은 National Collection of Type Cultures(NCTC)에서 균주를 공급받는 Minerva Biolabs(MB)에서 구입합니다. 감수성 표준은 불활성화된 마이코플라스마이며 마이코플라스마 검출을 위한 핵산 증폭 방법(qPCR/PCR 방법)의 방법론적 검증에 사용됩니다. EP 2.6.7 및 JP G3의 요구 사항을 포함하여 총 10종의 마이코플라스마를 구입합니다. 표준에 대한 정보는 다음과 같습니다.
|
공급업체 |
카탈로그 번호 |
NCTC 번호 |
ATCC 번호 |
재료 이름 |
|
미네르바 바이오랩스(MB) |
102-1003 |
10129 |
23838 |
10CFU ™ 민감도 표준 마이코플라스마 아르기니니 |
|
102-2003 |
10112 |
23714 |
10CFU ™ 민감도 표준 마이코플라스마 오랄레 |
|
|
102-3003 |
10115 |
19610 |
10CFU ™ 감도 표준 Mycoplasma gallisepticum |
|
|
102-4003 |
10119 |
15531 |
10CFU ™ 민감도 표준 마이코플라스마 폐렴 |
|
|
102-5003 |
10124 |
25204 |
10CFU ™ 민감도 표준 마이코플라스마 시노비아에 |
|
|
102-6003 |
10117 |
19989 |
10CFU ™ 민감도 표준 마이코플라스마 페르멘탄스 |
|
|
102-7003 |
10130 |
17981 |
10CFU ™ 민감도 표준 마이코플라스마 하이오리니스 |
|
|
102-8003 |
10116 |
23206 |
10CFU ™ 민감도 표준 아콜레플라스마 레이드라위이 |
|
|
102-9003 |
10164 |
27556 |
10CFU™ 감도 표준 Spiroplasma citri |
|
|
102-11003 |
10113 |
23064 |
10CFU ™ 감도표준 마이코플라스마 살리바리움 |
2.4 원본 데이터: 전자 버전은 상위 파일 'MycAway TM 마이코플라스마 실시간 qPCR 검출 키트(2G)'의 하위 파일인 '실험 보고서'에 기록되었습니다.
2.5 방법: 실험에 사용된 재료와 조작 방법은 기본적으로
- 자격내용 및 결과
3.1 검출 한계(LOD)
핵산 추출 및 10 CFU/mL 마이코플라스마 표준 균주 검출은 표준 균주에 대한 지침과 추출 및 검출 키트에 대한 지침에 따라 수행되었습니다. 10 CFU/mL 마이코플라스마 표준 균주에 대해 총 24개의 검정이 얻어졌습니다. NCS(음성 대조 샘플) 및 NTC(템플릿 대조 없음) 샘플은 각 실험에서 동시에 테스트되었습니다.
결과는 NCS 및 NTC 결과가 만족스럽고, 24개의 10 CFU/mL 샘플이 모두 양성으로 검사되어 24개 검사 중 최소 23개에서 양성 결과가 나와야 하는 요건을 충족했습니다.
|
아니요. |
재료 이름 |
세균액의 농도 |
|
1 |
마이코플라스마 아르기니니 |
10 CFU/mL |
|
2 |
마이코플라스마 오랄 |
10 CFU/mL |
|
3 |
마이코플라스마 갈리셉티쿰 |
10 CFU/mL |
|
4 |
마이코플라스마 폐렴 |
10 CFU/mL |
|
5 |
마이코플라스마 시노비아에 |
10 CFU/mL |
|
6 |
마이코플라스마 페르멘탄스 |
10 CFU/mL |
|
7 |
마이코플라스마 히오리니스 |
10 CFU/mL |
|
8 |
아콜레플라스마 레이드라위 |
10 CFU/mL |
|
9 |
스피로플라스마 시트리 |
10 CFU/mL |
|
10 |
마이코플라스마 침샘 |
10 CFU/mL |
표 1 검증된 균주에 대한 정보
|
10 CFU/mL |
실험 1 |
실험 2 |
실험 3 |
|
감지율 |
8/8 |
8/8 |
8/8 |
|
총 |
24/24 |
||
표 2 검출한계 결과
3.2 특이성
3. 2. 1 마이코플라스마 검사 범위
키트의 프라이머 프로브 시퀀스는 데이터베이스의 16S rRNA 게놈과 비교되었습니다. 생물정보학 분석을 통해 NextSense Biologicals의 MycAway TM Mycoplasma qPCR Detection Kit(Probe Method)는 120개의 Mycoplasma, 9개의 Ureaplasma, 33개의 Spiroplasma, 7개의 Cholestrongyla 등을 포함하여 최소 183개의 Zooxanthellae 종을 커버할 수 있다는 것을 알게 되었습니다.
3. 2. 2 샘플 매트릭스 간섭
9가지 기질(Dulbecco's MEM, Ham's F-10 Medium, M-199 Medium, Ham's F-12K Kaighn's, RPMI-1640 Medium, McCoy's 5A, Ham's F-12K Kaighn's+1.0mM/L Glutamine, L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2.05 mM L-Glutamine, DMEM-low glucose Standard Medium)을 샘플로 사용하여 샘플 매트릭스 간섭을 검증하였으며, 그 결과 이 배지가 키트 시약에 간섭을 일으키지 않는 것으로 나타났습니다.
3. 2. 3 플렉시박테리아 검출 범위
10 CFU/mL에서 불활성화된 마이코플라스마(마이코플라스마 아르기니니, 마이코플라스마 오랄레, 마이코플라스마 갈리셉티쿰, 마이코플라스마 뉴모니아, 마이코플라스마 시노비아, 마이코플라스마 페르멘탄스, 마이코플라스마 하이오리니스, 아콜레플라스마 레이드라위, 스피로플라스마 시트리, 마이코플라스마 살리바리움)를 추출하고 검출하는 것이 NCS 및 NTC 샘플 검사와 함께 필요합니다.
검사 결과, NCS와 NTC는 검출되지 않았고 결과는 음성이었고, 마이코플라스마 10종은 모두 검출되었고 결과는 양성이었습니다.
3. 2 . 4 교차 반응
Clostridium(Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus(Lactobacillus acidophilus), Streptococcus(Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), 기타 여러 일반적인 간균-구균-균류 미생물(Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus) 및 6가지 조작 세포(HEK293, 293T, Vero, CHO, E.coli)를 포함한 14가지 비플렉시박테리아 균주의 경우 SF9)는 잔류 DNA 샘플 전처리 키트(병)를 위한 MolPure TM 자기 비드 방법과 MycAway TM 마이코플라스마 qPCR 검출 키트(탐침 방법)(2G)를 사용하여 마이코플라스마 검출에 사용되었으며, 각 실험은 PCS, NCS 및 NTC 샘플 검사와 동시에 수행되었습니다.
결과는 PCS, NCS, NTC 결과가 만족스러운 것으로 나타났으며, 검사 샘플은 음성이었고 교차 반응도 발생하지 않았습니다.
3.3 견고성
3. 3.1 동결-융해 안정성
마이코플라스마 검사키트는 -25℃~-15℃의 조건에서 동결-해동 실험을 진행하였으며, 그 결과, 키트는 20회 반복 동결-해동에도 견딜 수 있었으며 성능에 영향이 없음을 확인하였습니다.
3. 3. 2 가속된 안정성
마이코플라스마 검출키트를 37℃에서 14일 동안, 4℃에서 30일 동안 각각 열가속화 처리한 결과, 제품 성능에 영향이 없는 것으로 나타났다.
3. 3. 3 기기 적용성
마이코플라스마 검출 키트의 경우, 키트에 있는 양성 대조군과 마이코플라스마 폐렴 DNA의 농도를 테스트 샘플로 사용했으며, Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S, Roche LightCycler®480의 네 가지 다른 브랜드와 모델에서 실험을 수행했습니다. 실험은 Shanghai Hongshi SLAN-96S와 Roche LightCycler®480의 네 가지 다른 브랜드와 모델의 qPCR 기기에서 수행했습니다.
결과에 따르면, 검사 대상 샘플은 다양한 제조업체의 모델에 따른 qPCR 기기에서 검출되었으며, 음성 대조 결과는 합격이었고, 키트 성능에는 영향을 미치지 않았습니다.
- 4 . 참조
4.1 마이코플라스마 검사 방법 <3301>. 중국 약전, 제3부 [S]. 베이징: 중국 과학 기술 출판사, 2020: 542-543.
4.2 분석 방법 검증 지침 <9101>. 중국 약전, 제3부 [S]. 베이징: 중국 과학 기술 출판사, 2020: 682.
4.3 의약품 미생물학적 검사를 위한 대체 방법의 검증 지침 <9201>. 중국 약전, 제3부 [S]. 베이징: 중국 과학 기술 출판사, 2020: 684.
4.4 마이코플라스마. 유럽 약전[S]. 제10판, 2020: 섹션 2.6.7, 194-199.
4.5 생명공학/생물학적 제품 생산에 사용되는 세포 기질에 대한 마이코플라스마 테스트 <G3-14-170>. 일본 약전[S]. 제18판, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J.Graham 등. 의도적인 마이코플라스마 오염 사건 동안 CHO 세포 생물 반응기 배양에서 생산된 단일 클론 항체의 제품 품질 속성에 대한 영향. 생명공학 및 생명공학. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. 세포 기질 및 생물학의 마이코플라스마 검사: 대체 비미생물학적 기술 검토. Mol Cell Probes. 2011년 4월-6월;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. 수의학 백신 및 생물학적 제품의 마이코플라스마 오염을 검사하기 위한 PCR 검출 방법. Lett in Applied Microbiology. 2015년 2월;60(2):174-180.
주문 정보
|
설명 |
부품 번호 |
|
18461ES |
|
| MycAway™ 마이코플라스마 qPCR 검출 키트(2G) | 40619ES |