등온 증폭 기술은 일정한 온도 조건에서 특정 핵산 서열을 증폭하는 목적을 달성할 수 있습니다. 특수 장비가 없고, 증폭 시간이 짧으며, 감도가 높은 특성으로 인해 현장 검출 및 진료소 진단에 좋은 적용 전망을 보였으며 분자 진단 도구 개발에 매우 ​​적합합니다.

변종과 감염성이 증가하는 신종 코로나바이러스 팬데믹 상황에서 등온 증폭 기술은 간단한 기구로 신종 코로나바이러스를 빠르게 검출할 수 있어, 전통적인 PCR 기술의 긴 검출 시간과 검출 장비 및 시약에 대한 높은 요구 사항으로 인해 일부 COVID-19 환자가 빠르게 확인되지 않는 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다. 그렇다면 등온 증폭 기술 중 하나인 RT-LAMP의 원리는 무엇일까요? Yeasen에서 제공할 수 있는 고품질 원료는 무엇일까요?

1. RT-LAMP의 원리는 무엇입니까?
2. RT-LAMP를 위한 프라이머 설계
3. Yeasen에서는 어떤 원자재를 제공할 수 있나요?
4. 제품 선택 가이드

1. RT-LAMP의 원리는 무엇입니까?

2000년 일본 학자 노토미 등은 루프 매개 등온 증폭(LAMP)이라는 새로운 핵산 증폭 기술을 확립했습니다. LAMP는 표적 유전자의 6개 영역에 대해 설계된 4개의 특정 프라이머를 사용하고, 스트랜드 치환 DNA 중합효소를 사용하여 등온 조건(60~65℃)에서 수십 분 내에 표적 서열의 109개 사본을 증폭합니다. 결과는 아가로스 젤 전기영동으로 판단했으며, 양성 결과는 사다리 모양의 띠를 보였습니다. LAMP는 강한 특이성, 높은 감도, 빠르고 간단한 작동, 낮은 비용이라는 특징을 가지고 있습니다. 이 기술의 지속적인 개선과 완성으로 현재 다양한 병원성 미생물의 검출에 사용되고 있습니다.

RT-LAMP는 LAMP 증폭 시스템에 역전사효소를 첨가하여 바이러스 RNA를 직접 검출하는 방법입니다. LAMP의 증폭 효율은 매우 높기 때문에 소량의 cDNA만으로도 많은 양의 핵산을 증폭할 수 있습니다. 핵산 증폭 과정에서 역전사 시간이 절약되고 RNA 검출 속도가 빨라집니다.

DNA는 약 65℃에서 동적 평형 상태에 있다. 가닥 치환 DNA 중합효소의 작용 하에, FIP 프라이머의 F2 세그먼트의 3' 말단에서 시작하여, 템플릿 DNA의 상보적 서열과 짝을 이루어 가닥 치환 DNA 합성을 개시한다. F3 프라이머는 F2c의 앞쪽 말단에서 F3c와 상보적이며, 3' 말단을 시작점으로 삼아 DNA를 합성하는 한편, 선두 FIP 프라이머에 의해 합성된 DNA 가닥을 가닥 치환 DNA 중합효소의 작용으로 대체한다. 앞으로 확장한다. 최종 F3 프라이머에 의해 합성된 DNA 가닥은 하나의 템플릿 DNA 가닥과 이중 가닥을 형성한다. FIP 프라이머에 의해 합성된 DNA 가닥은 F3 프라이머 가닥으로 대체되어 단일 가닥을 생성한다. 이 단일 가닥은 5' 말단에 상보적 F1c와 F1 세그먼트를 가지므로, 자가 염기 쌍을 이루어 원형 구조를 형성한다. 그리고 BIP 프라이머는 단일 가닥과 혼성화되어 결합되고, BIP 프라이머의 3' 말단을 시작점으로 하여 상보적 가닥을 합성하고, 그 과정에서 구조가 열린다. 그런 다음, F3 및 B3와 유사한 프라이머를 BIP 프라이머로부터 삽입하고, 염기 상보적 쌍을 수행하고, 3' 말단을 시작점으로 하여 새로운 상보적 가닥을 합성한다. 대체된 단일 가닥 DNA의 양 말단에는 상보적 서열이 존재하고, 자가 염기 쌍이 발생하여 원형 구조를 형성하므로 전체 사슬은 덤벨과 같은 구조를 나타낸다. 이 구조는 RT-LAMP 방법의 증폭 주기의 시작 구조이다.

덤벨 모양의 구조에서 DNA 확장은 3' 말단의 F1 세그먼트를 시작점으로 사용하고 자신을 템플릿으로 사용하여 수행됩니다. 그리고 FIP 프라이머 F2는 루프의 단일 가닥 F2c와 교잡하여 새로운 라운드의 가닥 치환 반응을 시작합니다. F1 세그먼트에서 합성된 이중 가닥 핵산은 분리되고 마찬가지로 핵산에 원형 구조가 형성됩니다. 원형 구조에는 B2c의 단일 가닥 형태가 있으며 BIP 프라이머의 B2는 이와 교잡하여 새로운 라운드의 증폭을 시작하고 동일한 과정을 통해 원형 구조가 형성됩니다. 이 과정에 따라 동일한 가닥의 상보적 서열은 페어링, 가닥 확장을 거쳐 순환하고 마지막으로 크기가 다른 구조를 형성합니다.

2. RT-LAMP를 위한 프라이머 설계

프라이머 디자인은 RT-LAMP의 성공적인 증폭 및 검출의 핵심입니다.RT-LAMP 프라이머에는 두 개의 바깥쪽 프라이머(F3 및 B3)와 두 개의 안쪽 프라이머(FIP 및 BIP)가 포함됩니다.F3 프라이머: F3 영역으로 구성된 상류 바깥쪽 프라이머는 표적 유전자의 F3c 영역과 상보적입니다.FIP 프라이머: F2 영역으로 구성된 상류 내부 프라이머, F2 영역의 표적 유전자 3' 말단에 있는 F2c 영역은 표적 유전자의 5' 말단에 있는 F1c 영역과 상보적입니다.BIP 프라이머: B2 영역으로 구성된 하류 내부 프라이머, B2 영역은 표적 유전자의 3' 말단에 있는 B2c 영역과 상보적이며 표적 유전자의 5' 말단에 있는 B1c 영역과 동일한 서열을 갖습니다.

PCR과 유사하게 프라이머 설계 원칙은 염기 조성, GC 함량 및 하부 구조와 같은 요인에 주의해야 합니다. 또한 다음 사항에 유의해야 합니다. 내부 프라이머 FIP 및 BIP의 5' 말단 부분, 즉 F1c 및 B1c는 일반적으로 길이가 8-50bp입니다. 길이는 바람직하게는 15~25bp이고 Tm 값은 3' 말단 부분에서 F2 및 B2의 Tm 값보다 큽니다. 내부 프라이머 FIP 및 BIP의 3' 말단 부분, 즉 F2 및 B2는 일반적으로 길이가 8-50bp입니다. 길이는 바람직하게는 15-25bp이고 Tm 값은 실험에서 선택된 Bst DNA 중합효소의 최적 온도와 일치합니다. 외부 프라이머 F3 및 B3의 길이는 일반적으로 8-50bp입니다. 길이는 바람직하게는 15-25 bp이고, Tm 값은 F2 및 B2보다 작습니다. 프라이머를 설계할 때 루프 구조와 타겟 시퀀스의 크기를 고려해야 합니다. 루프의 염기 수가 40bp보다 크고 타겟 시퀀스의 크기가 130-200bp일 때 증폭 효율이 가장 높습니다.

3. Yeasen에서는 어떤 원자재를 제공할 수 있나요?

3.1 [신규 업그레이드] Yeasen Bst Plus DNA Polymerase

새롭게 업그레이드된 Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase (Cat#14402ES, 14403ES)는 E.coli에서 5'→3' exonuclease 도메인이 없는 Bacillus stearothermophilus sp의 DNA polymerase 유전자를 발현 및 정제하여 얻습니다. 효소 가닥 치환 능력이 강하고, 고감도, 고증폭 효율, 고dUTP 내성이라는 장점이 있으며, 등온 증폭 기술을 기반으로 한 병원균의 실시간 검출에 널리 사용될 수 있습니다.

3.1.1 빠르고 높은 민감도

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase는 민감도가 높아 최소 5개 사본의 표적 유전자를 검출할 수 있습니다. 템플릿 양은 펨토그램(fg) 수준이며, 증폭 속도는 경쟁 제품보다 빠릅니다.

그림 1. RT-LAMP 반응은 Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase(오렌지)와 경쟁자 N(회색) 및 경쟁자 T(파란색)의 Bst 효소를 사용하여 SARS-CoV-2를 증폭했습니다. 결과에 따르면 Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase는 항상 경쟁 제품보다 더 빨리 임계값에 도달할 수 있으며 증폭 속도가 더 빠릅니다.

 

4. 제품 선택 가이드

Yeasen에서 제공하는 제품은 다음과 같습니다.

표 1. 제품 정보