비특이적 증폭을 줄이는 데 도움이 되는 Double-Block anti-Taq DNA Polymerase 항체

분자 진단은 IVD 분야에서 가장 빠르게 발전하는 하위 분야입니다. 짧은 검출 시간, 높은 민감도, 강력한 특이성이라는 장점이 있습니다. 종양 동반 진단 및 감염성 질환 및 유전성 질환의 스크리닝에 널리 사용됩니다. 분자 진단 분야에서 PCR은 시장 점유율이 가장 큰 가장 성숙한 기술 플랫폼일 뿐만 아니라 임상 진단의 "골드 스탠다드" 기술이기도 합니다. 전통적인 PCR 반응에서는 비특이적 증폭 문제가 종종 발생합니다. 비특이적 증폭은 검출 결과의 해석에 직접적인 영향을 미치고 증폭 민감도와 표적 단편의 수율 감소로 이어질 것입니다. 비특이적 증폭은 어떻게 발생하며 어떻게 효과적으로 피할 수 있습니까?

1. 기존 DNA 중합효소는 비특이적 증폭을 초래할 수 있습니다.

2. Hot Start Polymerase는 증폭 특이성을 향상시킬 수 있습니다.

3. 더블 블록 Taq 항체는 증폭 특이성과 안정성을 두 배로 향상시킬 수 있습니다.

4. Yeasen의 Double-Block Taq 항체의 성능 표시

5. 제품 정보

1. 기존 DNA 중합효소는 비특이적 증폭을 초래할 수 있습니다.

프라이머의 낮은 서열 특이성은 비특이적 증폭의 직접적인 원인입니다. 기존 DNA 중합효소의 프로모터로서, 그 엑소뉴클레아제 활성은 PCR 시스템을 준비하는 동안 DNA 프라이머 서열을 절단하여 프라이머의 특이성을 감소시킬 수 있습니다.

또한, 기존의 DNA 중합효소는 엑소뉴클레아제 활성뿐만 아니라 중합효소 활성도 가지고 있습니다. DNA 중합효소의 최적 연장 온도는 72℃이지만, 중합효소는 실온에서도 활성을 유지합니다. 따라서 PCR 반응을 준비하고 초기 가열하는 동안 프라이머는 일부 단일 가닥 템플릿과 비특이적 결합을 형성하고 Taq DNA 중합효소의 작용으로 연장되어 비타겟 서열이 증폭되고 반응의 특이성에 영향을 미칠 수 있습니다.

따라서 PCR 시스템은 종종 얼음 위에서 구성되어 DNA 중합효소의 활성을 억제합니다. 이 방법은 간단하고 저렴하지만 효소 활성을 완전히 억제할 수 없으므로 비특이적 생성물의 증폭을 제거할 수 없습니다.

2. Hot Start Polymerase는 증폭 특이성을 향상시킬 수 있습니다.

핫 스타트 중합효소는 핫 스타트 PCR의 핵심 구성 요소입니다. 실온에서 DNA 중합효소의 활성 부위는 효소 개질제에 의해 차단됩니다. 95℃에서 PCR 변성 후에야 효소 개질제가 떨어지고 효소 활동이 시작되어 효소로 인한 비특이적 증폭을 방지합니다.

현재 시중에 널리 사용되는 DNA 중합효소의 핫 스타트 변형 방법은 주로 화학적 방법, 리간드 방법, 항체 방법을 포함합니다. 그 중 항체 변형 핫 스타트 중합효소의 차단 효과가 가장 좋고 효소 활성의 방출 속도가 빠르므로 PCR의 반응 시간을 크게 줄일 수 있습니다. IVD 시장에서 널리 사용되는 핫 스타트 효소 변형 방법입니다.

그러나 전통적인 항체 핫 스타트 방법은 Taq DNA 중합효소의 5'→3' 중합효소 활성만 차단하여 낮은 온도에서 불일치 또는 프라이머 다이머로 인한 비특이적 증폭만 방지할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 위에서 언급했듯이 Taq DNA 중합효소는 5'→3' 중합효소 활성뿐만 아니라 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성도 가지고 있습니다. 이 엑소뉴클레아제 활성은 낮은 온도에서 불일치 프로브 또는 기타 물질의 분해로 이어져 일부 비특이적 신호가 발생할 수 있습니다.

3. 더블 블록 Taq 항체는 증폭 특이성과 안정성을 두 배로 향상시킬 수 있습니다.

국내 분자 효소 산업의 혁신적 리더인 Yeasen Biotechnology(Shanghai) Co., Ltd.(이하 Yeasen)는 분자 효소 원료의 R&D 및 생산에 집중하고 혁신을 감행합니다. 자체 성숙한 항체 스크리닝 플랫폼에 의존하여 Taq DNA 중합효소를 표적 분자로 하는 차단 항체를 스크리닝합니다. 수년간의 힘든 연구와 시스템 최적화를 거쳐 이중 차단 항-Taq DNA 중합효소 항체를 개발했습니다. Taq DNA 중합효소의 중합효소 활성을 차단할 수 있을 뿐만 아니라 Taq DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성도 차단할 수 있습니다. 두 가지 접근 방식으로 불일치 또는 프라이머 다이머로 인한 비특이적 증폭을 효과적으로 방지할 수 있을 뿐만 아니라 재료 분해로 인한 비특이적 신호 생성을 방지하고 시약의 안정성을 두 배로 향상시킬 수 있습니다.

4. Yeasen의 Double-Block Taq 항체의 성능 표시

4.1 Double-Block Taq 항체를 사용하면 정확하고 민감도가 더 높습니다.

Yeasen의 이중 차단 항체와 T사 항체로 Taq 중합효소를 차단한 후, 양성 검체를 ARMS-PCR로 검출하였다.

그림 1. ARMS-PCR 증폭 곡선; 파란색: T사 차단 항체; 빨간색: Yeasen의 이중 차단 항체

그림 1에서 볼 수 있듯이 Yeasen의 이중 차단 항체에 의해 차단된 Taq 중합효소는 ARMS-PCR 증폭에서 정확한 타이핑과 더 높은 민감도를 보입니다.

4.2 Double-Block Taq 항체는 Taq DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 효과적으로 차단합니다.

합성된 프라이머 프로브는 닫히지 않은 항체와 이중 차단된 항체에 의해 각각 차단된 Taq DNA 중합효소의 반응 용액과 매칭되어 40℃에서 반응하여 형광 신호를 검출했습니다.

그림 2. 엑소뉴클레아제 활성에 대한 이중 차단 항체의 차단 효율 검출; 노란색: 닫히지 않은 Taq DNA 중합효소 그룹; 보라색: 이중 차단 항체에 의해 차단된 Taq DNA 중합효소 그룹

그림 2에서 볼 수 있듯이 이중 차단 항체는 Taq DNA 중합효소의 에그조뉴클레아제 활성을 효과적으로 차단할 수 있습니다.

4.3 Double-Block Taq 항체는 검출 시약의 안정성을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다.

Taq DNA polymerase는 각각 전통적인 차단 항체와 이중 차단 항체로 차단되었고 프라이머 프로브를 포함하는 전체 프리믹스로 구성되었습니다. ASF 플라스미드 10000개를 4℃에서 10일 동안 또는 37℃에서 1, 3, 5일 동안 증폭시켰습니다. 증폭 곡선과 Ct 값 변화를 관찰했고, 전통적인 차단 항체와 이중 차단 항체가 전체 프리믹스 반응 용액의 안정성에 미치는 영향을 비교했습니다.

그림 3. 전통적인 차단 항체(a)와 이중 차단 항체(b) 차단 반응 용액으로 증폭된 10000개 ASF 플라스미드의 증폭 곡선; 파란색: 4℃에서 10일간 보관; 빨간색: 4℃에서 0일간 보관(대조군)

그림 3에서 볼 수 있듯이 이중 블록 항체는 반응 용액의 안정성을 유지하고 전통적인 차단 항체보다 검출 시약의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있습니다. 프라이머 프로브를 포함하는 전체 프리믹스를 이중 블록 항체로 차단하고 4℃에서 10일 동안 둔 후에도 증폭 곡선과 Ct 값은 크게 변하지 않았습니다.

그림 4. 전통적인 차단 항체(a)와 이중 차단 항체(b) 차단 반응 용액으로 증폭된 10000개 ASF 플라스미드의 증폭 곡선; 파란색: 37℃에서 5일 보관; 초록색: 37℃에서 3일; 노란색: 37℃에서 1일; 빨간색: 37℃에서 0일 보관(대조군)

그림 4에서 볼 수 있듯이 이중 블록 항체는 반응 용액의 안정성을 유지하고 전통적인 차단 항체보다 검출 시약의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있습니다. 이중 블록 항체는 프라이머-프로브가 포함된 전체 프리믹스를 차단하며, 37℃에서 1, 3, 5일 동안 둔 후 Ct 값의 차이는 0.2 미만입니다.

4.4 Double-Block Taq 항체는 기준선 드리프트 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.

일부 프라이머가 특정 버퍼 및 기기와 협력할 때, 베이스라인 드리프트가 발생합니다. Yeasen은 베이스라인 문제를 개선하기 위해 여러 방법을 시도했고, 이중 블록 항체가 안정적인 베이스라인에 더 도움이 된다는 것을 발견했습니다.

그림 5. N 유전자(a)와 ACT 유전자(b)의 증폭 곡선; 빨간색: 전통적인 차단 항체; 녹색: 이중 차단 항체

그림 5에서 볼 수 있듯이 특정 프라이머와 완충액 하에서 이중 차단 항체를 사용하면 기준선 드리프트 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

4.5 Double-Block Taq 항체를 사용하여 좋은 선형성을 얻었습니다.

ASF/ACT 이중 플라스미드를 100000, 10000, 1000, 1000개의 복제본으로 나누어 이중 블록 항체로 블로킹한 반응 용액으로 증폭하여 표준 곡선을 작성하였다.

그림 6. 더블블록 반응용액으로 생성된 ASF 유전자(a)와 ACT 유전자(b)의 표준곡선

그림 6에서 볼 수 있듯이 ASF 유전자의 표준곡선 R2는 0.998이고, 증폭 효율은 98.848%이다. ACT 유전자의 표준곡선 R2는 0.998이고, 증폭 효율은 98.113%이다.

4.6 Double-Block Taq 항체는 효소 활동을 빠르게 방출할 수 있습니다

Taq polymerase는 수입 T사 항체와 Yeasen의 이중 차단 항체(cat#31303) 로 각각 차단하였고, 효소 활성은 95℃에서 20초 동안 열 충격을 준 후 검출되었다. 31303은 95℃에서 20초 동안 열 충격을 준 후 효소 활성의 95% 이상을 방출할 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 T사 항체와 동등한 수준이다.

표 1. 효소 활성

4.7 더블 블록 Taq 항체는 다양한 유형의 Taq 효소를 차단할 수 있습니다.

세 가지 유형의 Taq 효소(야생형과 2가지 돌연변이)를 Yeasen의 이중 차단 항체(cat#31303)로 차단했으며, 차단 비율은 1 μg: 5 U로 형광 값과 봉합 효율을 측정했습니다. Yeasen의 이중 차단 항체(cat#31303)의 차단 효과는 다양한 유형의 Taq 효소에 더 나은 것을 알 수 있습니다.

표 2. 다양한 유형의 Taq 효소의 차단 효율

4.8 Yeasen의 Double-Block Taq 항체는 마우스에서 게놈 잔류물이 없었습니다.

음성 대조군의 템플릿으로 물을 사용하고 양성 대조군의 템플릿으로 마우스 게놈을 사용하여 31303개의 다른 배치를 증폭했습니다. 샘플에서 표적 단편이 증폭되지 않은 것으로 나타났으며, 이는 항체에 마우스 게놈 잔류물이 없음을 나타냅니다.

그림 7. 마우스 게놈 잔류물 검출 다이어그램

참고: -는 음성 대조군, +는 양성 대조군이며 1-5는 다양한 배치의 31303개 샘플입니다.

5. 제품 정보