2022년 3월 이후 교활한 오미크론 돌연변이 균주가 다시 한번 사람들의 평화로운 삶을 깨뜨렸고, 신종 코로나바이러스 전염병이 전국적으로 발생하여 30개 성(자치구 및 시정촌)에 영향을 미쳤습니다. SARS-CoV-2 전염병을 정확하게 예방하고 통제하는 효과적인 수단으로 핵산 검출은 정상적인 생활 방식이 되었습니다. "오늘 핵산 검사를 했습니까?" 또한 사람들의 일상적인 인사가 되었습니다. 그런데 핵산 검출에 필요한 핵심 원료가 무엇인지 알고 있습니까? 이 글에서는 핵산 검출 효소의 중요한 핵심 원료를 소개합니다.

1. SARS-CoV-2에 대한 핵산 검출 프로세스

2. 핵산 추출의 핵심 효소

3. RT-qPCR 동안의 핵심 효소

4. Yeasen의 SARS-CoV-2 핵산 검출의 핵심 효소

1. SARS-CoV-2에 대한 핵산 검출 프로세스

효소는 촉매 효율과 반응 특이성이 높은 매우 중요한 생촉매 클래스입니다. 대부분의 생화학 반응에는 효소의 참여가 필요합니다. 2019-nCoV의 핵산 검출 과정에서(그림 1 참조) 다양한 유형의 분자 효소가 핵산 추출 및 RT-qPCR과 같은 다양한 실험 단계에서 중요한 역할을 합니다. 다음으로, 핵산 검출의 다양한 실험적 연결에 따라 핵산 검출 과정에서 사용되는 핵심 효소 원료를 분류합니다.

그림 1. SARS-CoV-2에 대한 핵산 검출 프로세스

2. 핵산 추출의 핵심 효소

신종 코로나바이러스 핵산 추출 공정은 주로 용해와 정제의 두 단계로 구성됩니다. 용해는 샘플의 세포 구조를 파괴하여 샘플의 핵산이 용해 시스템에서 자유롭게 되도록 하는 과정입니다. 정제는 핵산을 단백질, 염 및 기타 불순물과 같은 용해 시스템의 다른 구성 요소에서 완전히 분리하는 것이며, 반응 과정에는 단백질 분해 효소 K, 탈옥시리보핵산 분해 효소 I 및 RNase 억제제의 참여가 필요합니다.

2.1 프로테아제 K

Proteinase K는 광범위한 절단 활성을 가진 세린 프로테아제이며, 절단 부위는 지방족 및 방향족 아미노산의 카르복시 말단 펩타이드 결합입니다(그림 2). 핵산 추출 과정에서 proteinase K는 핵산과 단단히 결합된 히스톤을 분해하고, 핵산 분리를 촉진하며, 샘플 핵산을 추출하기 쉽게 만들 수 있습니다. 또한 proteinase K는 RNA 가수분해효소(RNase) 활성을 분해하고 템플릿 RNA의 RNase 가수분해를 억제할 수 있습니다.

그림 2. 단백질 분해효소 K가 펩타이드 결합을 가수분해하는 개략도

Yeasen Biotech Proteinase K (Cat#10401ES)는 재조합 효모 균주에서 유래되었으며, 특정 활성 ≥30 U/mg, RNase 및 DNase가 없으며, 요소 및 SDS 용액에서 효소 활성이 안정적입니다. 광범위한 pH 범위(pH 4.0~12.0)에서 활성이 있으며, in situ 하이브리다이제이션 샘플 준비 및 핵산 정제와 같은 단백질의 절단 및 제거에 적합합니다.

2.2 데옥시리보핵산분해효소 I

데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I)는 다양한 형태의 DNA를 촉매하고, 피리미딘에 인접한 인산디에스테르 결합을 절단하고, 5' 말단에 인산기와 3' 말단에 히드록실기를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 생성하며, 평균 소화 생성물은 가장 작은 폴리테트라뉴클레오타이드입니다. SARS-CoV-2 핵산 추출 과정에서 DNase I은 주로 RNA 샘플의 게놈 오염을 제거하고, RNA 템플릿의 DNA 잔류물을 피하고, 템플릿의 순도를 높이는 데 사용됩니다.

Yeasen Biotech DNase I (Cat#10325ES)는 재조합 E. coli 균주에서 유래한 RNase-free이며 다양한 RNA 샘플의 처리에 사용할 수 있습니다. 최적의 작동 pH 범위는 7.0-8.0입니다. Mg2+가 존재할 경우 DNase I은 이중 가닥 DNA의 모든 부위를 무작위로 절단할 수 있는 반면 Mn2 ^+가 존재할 경우 DNase I은 동일한 부위에서 이중 가닥 DNA를 절단하여 블런트 말단 또는 1-2개 뉴클레오티드 오버행 스티키 말단을 형성합니다(그림 3 참조).

그림 3. Mg ²⁺ 및 Mn ²⁺ 존재 하에서 dsDNA를 절단하는 DNase I의 개략도

2.3 RNase 억제제

SARS-CoV-2 핵산 검출 과정에서 샘플 핵산의 추출 및 정제 또는 실험 반응 시스템의 제조는 리보뉴클레아제(RNase) 오염을 도입하여 RNA 템플릿의 분해를 초래할 수 있습니다. RNase 오염을 피하기 위해 RNase Inhibitor가 필요합니다.

RNase Inhibitor는 인간 태반의 특정 RNase 억제제로, RNase를 특이적으로 결합하여 비공유 결합으로 복합체를 형성하고 RNase를 불활성화할 수 있습니다. Yeasen Biotech Murine RNase Inhibitor (Cat#10603ES)는 인간 단백질의 산화에 매우 민감한 두 가지 시스테인을 포함하지 않습니다. 항산화 활성이 더 높고 다양한 유형의 RNase(RNase A, B, C)를 광범위하게 억제할 수 있어 qPCR과 같은 높은 디티오트레이톨(DTT)에 민감한 실험에 더 적합합니다.

3. RT-qPCR 동안의 핵심 효소

SARS-CoV-2 샘플의 핵산 추출이 완료된 후, RT-qPCR로 핵산 검출을 완료할 수 있습니다. 이러한 실험 과정에서 DNA 중합효소, 역전사효소, 우라실 DNA 글리코실라제는 모두 필수적인 핵심 효소 원료입니다.

3.1 역전사효소

추출 및 정제 후, SARS-CoV-2 RNA는 역전사효소가 dNTP 중합을 촉매하여 템플릿 RNA에 상보적인 cDNA 서열을 생성해야 합니다(그림 4). RT-qPCR 반응의 경우 고온 내성 역전사효소를 선택해야 합니다. 현재 MMLV 역전사효소가 가장 널리 사용되고 있으며, DNA 엔도뉴클레아제 활성이 없고 RNase H 활성이 낮기 때문에 cDNA 클로닝 응용 분야에서 더 많은 이점이 있습니다.

그림 4. 역전사 과정의 개략도

Yeasen Biotech Hifair™ V 역전사효소 (Cat#11300ES)는 유전공학 기술을 통해 얻은 새로운 역전사효소입니다. 열 안정성이 뛰어나고 최대 60°C의 반응 온도를 견딜 수 있습니다. 또한 복잡한 2차 구조를 가진 RNA 템플릿의 역전사에도 적합합니다. 동시에 이 효소는 템플릿과의 친화성을 높이고 소수의 템플릿과 저복사 유전자의 역전사에 적합하며 최대 10kb의 cDNA를 증폭할 수 있습니다.

3.2 DNA 중합효소

이중 가닥 cDNA를 생성하기 위한 템플릿 역전사 과정이 완료되면, PCR 반응에서 "소울 플레이어" DNA 중합효소가 등장하여 자유 디옥시리보뉴클레오타이드를 중합하여 DNA 사슬을 확장하고, 대량의 템플릿 DNA가 시험관 내에서 증폭되어 바이러스 핵산 검출 목적을 달성합니다.

RT-qPCR 반응에서 일반적으로 사용되는 DNA 중합효소는 핫스타트 Taq DNA 중합효소입니다. 이 유형의 효소는 실온에서 불활성입니다. 핫스타트 후에만 중합 활성을 가지므로 배경 신호 생성을 최소화할 수 있습니다. 기존 PCR 반응에서 프라이머-다이머 생성 또는 불일치로 인해 발생하는 비특이적 증폭 문제를 해결합니다. 현재 일반적으로 사용되는 DNA 중합효소 핫스타트 수정 방법에는 주로 화학적 수정, 리간드 수정 및 항체 수정이 포함됩니다. 다양한 핫스타트 수정 방법의 원리는 그림 5에 나와 있습니다.

그림 5. 다양한 유형의 변형된 핫스타트 효소의 개략도

Yeasen Biotech UNICONTM Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase , 5 U/μL(Cat#10726ES)는 높은 템플릿 친화도를 가진 이중 차단 핫스타트 DNA 중합효소입니다. 실온에서 5'→3' 중합효소 활성뿐만 아니라 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성도 차단됩니다. 95°C에서 30초 동안 변성시키면 차단 항체가 완전히 불활성화되어 DNA 중합효소 활성과 엑소뉴클레아제 활성이 방출됩니다. 이중 차단 기능은 불일치 또는 프라이머 다이머로 인한 비특이적 증폭을 효과적으로 방지할 수 있을 뿐만 아니라 프로브 분해로 인한 형광 신호 감소를 효과적으로 억제할 수 있습니다. 이중 보장은 운반 중 또는 실온에서 사용하는 동안 시험관 내 검출 시약을 더욱 안정적으로 만듭니다.

3.3 우라실 DNA 글리코실라제

새로운 코로나바이러스 핵산 검출 과정에서 운영 환경의 에어로졸 오염은 거짓 양성 PCR 결과를 유발하는 가장 일반적인 요인입니다. 증폭 시스템에 UDG 효소(우라실 DNA 글리코실라제, 우라실 DNA 글리코실라제)를 추가하면 PCR 시스템에 섞인 증폭 잔류 오염 물질(대부분 에어로졸 형태)을 효과적으로 제거하여 증폭 결과의 정확성을 보장할 수 있습니다. UDG 효소의 오염 방지 원리는 그림 6에 나와 있습니다.

그림 6. UDG 효소의 오염방지 원리의 개략도

Yeasen Biotech Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG), 열에 불안정한 1 U/μL(Cat#10303ES)는 25-37°C에서 활성을 띠고, 열에 민감하며, 50°C에서 10분 또는 95°C에서 2분 동안 비가역적으로 불활성화됩니다. 엔도뉴클레아제와 RNase 잔류물이 없으며, 숙주 박테리아 게놈 잔류물은 10개 미만입니다. 증폭 반응의 특이성을 보장하기 위해 핫스타트 Taq DNA 중합효소와 함께 사용할 수 있습니다.

4. Yeasen의 SARS-CoV-2 핵산 검출의 핵심 효소

독서에 관하여:

역전사효소 선택

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