T7 고수율 RNA 합성 키트는 전사 반응 시스템을 최적화합니다. 이 키트는 T7 RNA 중합효소, T7 프로모터 서열을 템플릿으로 하는 선형 이중 가닥 DNA, 프로모터 하류의 DNA 서열을 제어하는 ​​기질인 NTP를 사용하여 단일 가닥 RNA를 효율적으로 합성할 수 있습니다. 전사 중에 변형된 뉴클레오타이드를 기질에 추가하여 바이오틴 또는 염료 표지된 RNA를 제조할 수 있습니다.

1. T7 High Yield RNA Synthesis Kit 소개
2. 시험관 내 전사의 원리
3. Yeasen T7 고수율 RNA 합성 키트의 장점
4. 제품 성능
5. 이 키트를 사용하는 방법
6. 자주 묻는 질문
7. 주문 정보

1. T7 High Yield RNA Synthesis Kit 소개

T7 고수율 RNA 합성 키트는 긴 전사본과 짧은 전사본을 모두 합성할 수 있으며, 1μg의 DNA 템플릿 입력으로 100-200μg의 RNA를 생산할 수 있습니다. 합성된 RNA는 RNA 구조 및 기능 연구, RNase 보호, 프로브 하이브리다이제이션, RNA 간섭, 미세주입 및 시험관 내 번역과 같은 다양한 다운스트림 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.

2. 시험관 내 전사의 원리

그림 1. 시험관 내 전사 과정

3. Yeasen T7 고수율 RNA 합성 키트의 장점

매우 높은 수율 - 2시간 안에 최대 200µg
다재다능함 - 20nt-10000nt RNA 전사본에 적합
다양한 용도 - 라벨이 붙지 않은 RNA, 라벨이 붙은 RNA 또는 캡이 붙은 RNA 생성

4. 제품 성능

그림 2. IVT 수율 비교

참고: 모든 반응 시약은 T7 RNA 합성 키트 (Yeasen#10623 또는 B* 회사)에서 나온 것입니다. 위에는 Yeasen과 B* 회사의 IVT 반응 수율이 나와 있습니다.

그림 3. 다양한 길이에 따른 전사산물의 품질

그림 4. HEK-293 세포에서 전사된 mRNA의 발현 수준

참고사항: mRNA는 Vaccinia Capping Enzyme(Yeasen#10614/10615)으로 캡핑되었습니다.

5. 이 키트를 사용하는 방법

5.1 시약 해동

T7 RNA Polymerase Mix를 잠시 원심분리하고 얼음 위에 놓습니다. 10× 전사 완충액과 리보뉴클레오타이드(ATP, CTP, GTP, UTP)를 녹이고, 튜브 바닥까지 섞고 원심분리하고, 10× 전사 완충액을 실온에 두고 4가지 유형의 리보뉴클레오타이드를 얼음 위에 놓습니다.

5.2 다음 표에 따라 전사반응 시스템을 준비하세요.

표 1. 전사반응계의 제조방법

메모:
a) 반응은 실온에서 준비합니다. 10× 전사 완충액에는 스페르미딘이 포함되어 있으므로 낮은 온도에서 스페르미딘 농도가 너무 높으면 DNA 템플릿 침전이 발생합니다.
b) 짧은 전사본(<100 nt), 2 µg 템플릿 사용 가능, 전사 시간은 4-8시간으로 증가함.
c) 긴 전사본(>1000nt)의 경우, 선형화된 플라스미드 템플릿을 전사에 사용하는 것이 좋습니다.
d) 반응 용액이 장시간 증발하는 것을 방지하기 위해 뜨거운 뚜껑을 열어둔 채 PCR 기계에서 반응을 수행합니다.
e) 반응 생성물은 흰색 침전물을 가질 수 있습니다. 이것은 반응 중에 자유 피로인산과 마그네슘 이온에 의해 형성된 피로인산 마그네슘이며, 이는 후속 실험에 영향을 미치지 않습니다. EDTA를 첨가하여 제거할 수 있습니다. EDTA 첨가가 후속 실험에 영향을 미치는지 걱정된다면 원심분리로 상층액을 회수할 수도 있습니다.
f) 시약과 용기는 RNase 오염이 없어야 합니다.

5.3 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.

위의 반응 용액을 섞고, 튜브 바닥까지 잠시 원심분리하고, 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 전사 길이가 100nt 미만이면 반응 시간을 4-8시간으로 늘립니다.

5.4 DNase I 처리(선택 사항)

반응이 완료되면 각 튜브에 DNase I(RNase free) 2 μL를 첨가하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 템플릿 DNA를 제거합니다.

6. 자주 묻는 질문

6.1 IVT 반응의 수율이 낮습니다

템플릿 품질은 수율과 밀접한 관련이 있습니다. 실험군의 수율이 양성 대조군보다 상당히 낮은 경우, 가능한 이유는 다음과 같습니다.
① 템플릿에는 IVT 반응을 억제하는 성분이 포함되어 있습니다.
② 템플릿에 문제가 있습니다.

6.2 제안

① 템플릿을 다시 정제합니다.
② 템플릿의 농도 및 무결성을 확인합니다.
③ 반응시간을 늘리세요.
④ 템플릿의 입력을 늘립니다.
⑤다른 RNA 중합효소와 해당 프로모터를 시도해 보세요.

6.3 짧은 전사본의 수율이 낮습니다.

표적 전사본이 100nt보다 짧은 경우 반응 시간을 4~8시간으로 늘리거나 20 μL 반응 시스템에서 템플릿 입력을 2ug로 늘립니다.

6.4 예상치 못한 긴 대본이 있습니다.

겔 전기영동 결과에서 예상치 못한 긴 전사본이 발견되는 경우, 가능한 이유는 다음과 같습니다.
① 플라스미드 템플릿은 완전히 선형화되지 않았을 수 있습니다.
②템플릿은 3' 돌출부가 있는 결합된 끝부분을 가지고 있습니다.
③전사물은 완전히 변성되지 않은 2차 구조를 가지고 있습니다.

6.5 제안

① 플라스미드 템플릿이 완전히 선형화되었는지 확인합니다. 필요한 경우 플라스미드 선형화를 다시 수행합니다.
② 플라스미드 템플릿을 선형화하고 3' 오버행이 있는 응집성 끝을 생성하지 않도록 적합한 제한 효소를 선택합니다. 필요한 경우 클레노우 단편이나 T4 DNA 중합효소를 사용하여 블런트 끝을 생성하는 것이 실용적입니다.
③ 변성겔을 이용하여 전사물을 검출한다.

6.6 예상치 못한 짧은 대본이 있습니다.

겔 전기영동 결과에서 예상치 못한 짧은 전사본이 발견되는 경우, 그 이유는 다음과 같습니다.
①템플릿에는 T7 RNA 중합효소의 종결서열과 유사한 서열이 존재한다.
②템플릿의 GC 함량이 높다.

6.7 제안

① 반응 온도를 낮춥니다(예: 30℃). 단, 반응 온도를 낮추면 수율이 감소할 수 있음을 유의하세요.
②IVT 반응을 촉진하기 위해 다른 RNA 중합효소를 시도해 보세요.
③템플릿의 GC 함량이 높을 경우 IVT 반응 온도를 42℃로 설정하거나 IVT 반응 시스템에 SSB를 첨가하여 수율을 높이고 전사체 길이를 늘린다.

6.8 겔 전기영동 중 전사본이 번짐

겔 전기영동 중 전사본이 번지는 경우 다음과 같은 이유가 있을 수 있습니다.
①실험 수행 중 RNase 오염이 발생합니다.
②DNA 템플릿은 RNase에 의해 오염됩니다.

6.9 제안

① 모든 시약이 RNase-free H2O로 제조되었는지 확인하십시오. RNase-free 피펫 팁과 Eppendorf 튜브를 사용하고 실험 작업 중에는 일회용 라텍스 장갑과 마스크를 착용하십시오.
②DNA 템플릿을 재 정제합니다.

7. 주문 정보

다음은 Yeasen에서 제공하는 대표적인 제품입니다. 추가 사이즈도 이용 가능합니다. 당사의 제품은 함께 작동하도록 고도로 최적화되어 있어 뛰어난 성능과 재현성을 보장합니다.
맞춤형 서비스도 제공할 수 있습니다. 표시되지 않은 제품에 관심이 있다면 저희에게 연락하세요. 귀하의 요구 사항을 충족하기 위해 귀하와 협력하겠습니다.

표 2. 제품 정보

 

독서에 관하여:

mRNA 시험관 내 합성을 위한 GMP 등급 시약

Yeasen Biotechnology GMP Grade mRNA 시험관 내 합성 원료