그만큼 d T7 고수율 RNA 합성 키트 설명

T7 고수율 RNA 합성 키트는 전사 반응 시스템을 최적화합니다. 이 키트는 T7 RNA 중합효소, T7 프로모터 서열을 템플릿으로 하는 선형화된 이중 가닥 DNA, 프로모터 하류의 DNA 서열을 전사하기 위한 기질인 NTP를 사용하여 단일 가닥 RNA를 효율적으로 합성할 수 있습니다. 전사 중에 변형된 뉴클레오타이드를 기질 로 추가하여 바이오틴 또는 염료 표지된 RNA를 생산할 수도 있습니다.

이 키트는 긴 전사본과 짧은 전사본을 모두 합성할 수 있으며 , 1μg의 DNA 템플릿 입력으로 100-200μg의 RNA를 생산할 수 있습니다. 전사에 의해 합성된 RNA는 RNA 구조 및 기능 연구, RNase 보호, 프로브 하이브리다이제이션, RNAi, 마이크로주입 및 시험관 내 번역과 같은 다양한 다운스트림 애플리케이션에 사용할 수 있습니다 .

합성 원리

그림 1: 시험관 내 RNA 전사 과정

제품의 장점

고수율 : 전사반응을 통해 2시간 내에 최대 200μg 생산 가능

더 나은 다용성: 20nt-10000nt RNA 전사에 적합

우수한 성능: IVT 과정 중 전사 부산물을 효과적으로 감소시킵니다.

다양한 응용 분야: 일반, 표지 및 수정 RNA 합성에 사용 가능

제품 속성

그림 2: 다양한 길이의 전사본 수율

그림 3: 다양한 길이의 필사본 품질

그림 4: HEK-293 세포에서 전사된 mRNA의 발현

참고사항: mRNA는 Vaccinia Capping Enzyme(Yeasen#10614/10615)으로 캡핑되었습니다.

실험 방법

시약 해동

T7 RNA Polymerase Mix를 잠시 원심분리하고 얼음 위에 놓습니다 . 10×Transcription Buffer와 리보뉴클레오타이드(ATP, CTP, GTP, UTP)를 녹이고 , 튜브 바닥까지 섞고 원심분리하고, 10×Transcription Buffer를 실온에 두고, 4가지 유형의 리보뉴클레오타이드를 얼음 위에 놓습니다.

B. 실온에서의 조립전사 반응

다음 시스템에 따라 반응 시스템을 준비하세요.

구성 요소	용량(µL)	최종 농도
RNase가 없는 H ₂ O	최대 20개	-
10×전사 버퍼	2	1×
CTP / GTP / ATP / UTP (각각 100 mM)	각각 2개씩	각각 10 mM
템플릿 DNA	1마이크로그램	-
T7 RNA 중합효소 혼합물	2	-

참고사항:

반응은 실온에서 구성됩니다. 10× 전사 완충액에는 스페르미딘이 포함되어 있으므로, 고농도의 스페르미딘은 낮은 온도에서 DNA 템플릿 침전을 일으킬 수 있습니다.
짧은 전사본(<100nt)의 경우, 2 µg 템플릿을 사용할 수 있으며, 전사 시간은 4~8시간으로 연장됩니다.
3. 긴 전사본(>1000nt)의 경우 전사를 위한 템플릿으로 선형화된 플라스미드를 사용하는 것이 좋습니다.
4. 증발을 방지하기 위해 뜨거운 뚜껑을 열어둔 상태에서 PCR 기기에서 반응을 수행합니다.
5. 반응 생성물은 흰색 침전물을 가질 수 있습니다. 침전물은 반응 용액에서 자유 피로인산염과 마그네슘 이온에 의해 생성된 피로인산 마그네슘으로, 후속 실험에 영향을 미치지 않습니다. 이를 제거하고 싶다면 EDTA를 추가할 수 있습니다. EDTA를 추가하여 후속 실험에 영향을 미치는 경우 원심분리로 상층액을 회수할 수도 있습니다.
6. 시약과 용기를 RNase 오염 없이 보관하세요.

C. 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.

성분 용액을 섞고, 튜브 바닥까지 잠시 원심분리하고, 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 전사 길이가 100nt 미만이면 반응 시간을 4-8시간으로 늘립니다.

D.DNase I 처리 (선택)

반응이 완료되면 각 튜브에 DNase I(RNase free) 2 μL를 첨가하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 템플릿 DNA를 제거합니다.

자주 묻는 질문

낮은 전사 수율

템플릿의 품질은 수율과 밀접한 관련이 있습니다. 실험군의 수율은 대조군보다 상당히 낮습니다. 가능한 이유는 다음과 같습니다.

실험 템플릿에는 억제 구성 요소가 포함되어 있습니다.
아마도 템플릿에 문제가 있을 겁니다.

제안: ① 템플릿 재정제; ② 템플릿 정량 및 무결성 확인; ③ 반응 시간 연장; ④ 템플릿 입력량 증가; ⑤ 다른 프로모터 및 다른 RNA 중합효소 사용.

짧은 필사본의 수율이 낮음

짧은 템플릿 단편은 반응을 억제할 수 있습니다. 전사 산물이 100nt 미만일 때 수율을 높이려면 반응 시간을 4-8hs로 늘리거나 템플릿 양을 2μg로 늘리십시오.

RNA 전사 길이가 예상보다 깁니다

전기영동 결과에서 생산물 밴드가 예상 크기보다 큰 경우, 다음과 같은 이유가 있을 수 있습니다. ① 플라스미드 템플릿이 완전히 선형화되지 않았을 수 있습니다. ② 센스 가닥의 3' 말단이 눈에 띄는 구조를 가지고 있습니다. ③ RNA가 완전히 변성되지 않은 2차 구조를 가지고 있습니다.

제안: ①템플릿이 완전히 선형화되었는지 확인하고 필요한 경우 추가 선형화를 수행합니다. ②3' 오버행을 피하기 위해 적절한 제한 효소를 선택하거나 Klenow Fragment/T4 DNA 중합효소를 사용하여 계속 진행하기 전에 전사를 완료합니다. ③변성된 젤을 사용하여 RNA 생성물을 검출합니다.

RNA 전사 길이가 예상보다 짧습니다.

전기영동 결과, 생산물 밴드가 예상 크기보다 작은 경우 다음과 같은 이유가 있을 수 있습니다. ① 템플릿에 T7 RNA 중합효소 종결자와 유사한 종결 서열이 포함되어 있음 ② 템플릿의 GC 함량이 너무 높음.

제안: ① 반응 온도를 낮추세요(예: 30°C). 때로는 온도를 낮추면 전사 길이를 늘리는 데 도움이 될 수 있지만 수율이 감소할 수 있습니다. 전사를 위해 다른 RNA 중합효소를 시도하세요. ② 템플릿 GC 함량이 높으면 42℃에서 반응을 수행하거나 SSB를 추가하여 수율과 전사 길이를 늘리세요.

전사산물의 전기영동 테일링

전기영동 중 테일링 현상은 다음과 같은 이유로 발생할 수 있습니다. ① 실험 작업 중 RNase 오염 ② DNA 템플릿이 RNase로 오염됨.

제안: ① RNase가 없는 피펫 팁과 EP 튜브를 사용하고, 일회용 라텍스 장갑과 마스크를 착용하고, 모든 시약은 RNase가 없는 H ₂ O로 준비합니다. ② 템플릿 DNA를 재정제합니다.

주문 정보

제품 이름	카탈로그 번호	사양
T7 고수율 RNA 합성 키트	10623ES	50/100/500톤
T7 RNA 중합효소 GMP 등급(250 U/μL)	10625ES	10KU/100KU/2500KU/25MU
피로포스파타제, 무기 GMP 등급(1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
쥐 RNase 억제제 GMP 등급(40 U/μL)	10621ES	10KU/20KU/100KU/1MU
mRNA 백신 캡핑 효소 GMP 등급	10614ES	2KU/10KU/100KU
mRNA Cap 2'-O-메틸트랜스퍼라제 GMP 등급	10612ES	10KU/50KU/250KU
디옥시리보핵산분해효소 I (DNase I) GMP 등급	10611ES	500/2000/10000유로
Hieff NGS® mRNA 분리 마스터 키트	12603ES	24/96티

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T7 High Yield RNA Synthesis Kit은 다양한 길이의 전사본을 효율적으로 합성할 수 있도록 도와줍니다.