고처리량 시퀀싱에서 기존 라이브러리 구축에는 PCR 증폭이 필요합니다. 한편으로는 미량 DNA 샘플을 증폭하여 라이브러리 수율을 높이는 것입니다. 다른 한편으로는 형광 신호를 증폭하여 시퀀서가 형광 신호를 포착하고 식별하여 시퀀싱 정확도를 개선하기 쉽게 만들 수 있습니다. 그러나 PCR은 "양날의 검"과 같습니다. 초기 샘플 볼륨이 낮다는 문제를 해결하고 형광 신호를 증폭하는 동시에 증폭 오류와 편향이 발생하여 게놈 시퀀스 "진면"을 완벽하게 표현할 수 없습니다. 또한 PCR 중합효소에는 일정한 증폭 편향이 있습니다. 일부 영역, 특히 높은 GC 또는 낮은 GC, 2차 구조 및 기타 영역은 증폭 효율이 낮고 커버하기 어렵습니다. 또한 많은 수의 잘못된 InDels를 도입하고 많은 수의 복제를 가져와 DNA 데이터 볼륨을 낭비하고 시퀀싱 비용을 증가시킵니다. 따라서 PCR-Free 기술의 도입은 PCR의 장점뿐만 아니라 PCR의 단점도 극복합니다. 높은 감도의 고품질 라이브러리를 가져올 뿐만 아니라 미량 샘플의 검출을 실현할 수 있으며 높은 정확도를 갖고 변형 연구에 대한 후속 검증 작업 부하를 줄일 수 있습니다. 그렇다면 PCR-Free 라이브러리는 정확히 무엇이고 그 장점은 무엇입니까?

1. PCR-Free 라이브러리란 무엇입니까?
2. PCR-Free 기술의 장점은 무엇입니까?
3. PCR-Free의 데이터 표시
4. 자주 묻는 질문
5. 제품 정보
6. 독서에 관하여

1. PCR-Free 라이브러리란 무엇입니까?

차세대 시퀀싱 기술은 현대 분자 생물학에서 고처리량 시퀀싱 연구에 가장 일반적으로 사용되는 기술입니다. 기존의 1세대 시퀀싱은 더 이상 연구자의 요구를 충족시킬 수 없습니다. 모델 생물의 게놈 재시퀀싱과 비모델 생물의 게놈 시퀀싱에는 더 많은 비용이 필요합니다. 낮고, 더 높은 처리량, 더 빠른 시퀀싱 기술로 2세대 시퀀싱 기술이 탄생했습니다. 2세대 시퀀싱 기술의 핵심 원리는 합성에 의한 시퀀싱, 즉 새로 합성된 말단 표지 염기 정보를 포착하여 DNA 서열을 결정하는 것입니다. DNA 시퀀싱을 위한 2세대 시퀀싱 기술의 주요 원리는 먼저 DNA를 단편화하고, 단편화된 DNA의 말단을 복구한 다음, 양쪽에 특정 어댑터를 추가한 다음 다양한 방법을 사용하여 수백만 개의 공간적으로 고정된 PCR을 생성하는 것입니다. 클론 어레이의 경우, 프라이머 하이브리디제이션과 효소 연장 반응을 사용하여 각 연장 반응에 의해 통합된 형광 라벨을 이미지화하여 시퀀싱 데이터를 얻습니다.

차세대 시퀀싱을 통한 DNA 시퀀싱은 주로 라이브러리 준비와 온머신 시퀀싱의 두 가지 프로세스를 포함합니다. 라이브러리 준비 중에 무작위로 중단된 게놈 단편은 일반적으로 표준 PCR에 의해 증폭됩니다. 그러나 일부 특수 템플릿의 경우 복잡한 2차 구조 또는 열 안정성이 좋지 않은 것과 같은 요소가 템플릿 PCR의 증폭 선호도에 영향을 미치므로 모든 게놈 시퀀스가 ​​PCR 증폭 라이브러리에 동일하게 반영될 수 없습니다. 특히 GC 또는 AT 함량이 높은 일부 템플릿의 경우 라이브러리 구축을 위해 PCR 방법을 사용하여 증폭하기 어려울 때가 있습니다. 라이브러리 구축 프로세스 중에 PCR이 수행되지 않는다는 점을 제외하면 머신에서 시퀀싱할 때 PCR 없는 라이브러리와 기존 PCR 라이브러리 사이에는 차이가 없습니다. PCR 없는 라이브러리는 이론적으로 데이터 판독 분포를 개선하고 보다 균일한 게놈 커버리지를 생성할 수 있습니다. PCR 없는 라이브러리는 라이브러리 구축 방법을 보완합니다. PCR 증폭 없이 온보드 라이브러리에 직접 준비되므로 일부 높은 GC 또는 높은 AT 영역의 적용 범위를 개선하여 PCR에 의해 발생하는 오류 염기, 데이터 편향 및 시퀀스 반복을 줄일 수 있습니다.

기존 NGS 라이브러리 구축의 핵심 단계는 시퀀싱 전 게놈 단편화, 말단 복구, 어댑터 추가, PCR 및 신호 증폭입니다. 그렇다면 PCR-Free 라이브러리 구축은 어떨까요? 이름에서 알 수 있듯이 PCR이 필요 없는 라이브러리 구축 프로세스입니다. 라이브러리 구축의 핵심 단계는 게놈 단편화, 말단 수정, 링커 추가 및 라이브러리 품질 관리입니다. 하지만 사실 이는 라이브러리 구축 프로세스에서만 PCR-Free로 간주될 수 있습니다. 진정한 PCR-Free는 라이브러리 증폭(예: 단일 분자 시퀀싱 기술) 없이 라이브러리 구축에서 시퀀싱까지의 프로세스이거나 PCR 증폭 오류가 축적되지 않는 시퀀싱 기술(예: MGI의 DNBseq)이어야 합니다.

그림 1. 기존 라이브러리 구축 및 PCR-Free 라이브러리 구축의 흐름도

2. PCR-Free 기술의 장점은 무엇입니까?

일상적인 라이브러리 구축 과정에서 증폭 효소는 오류를 유발할 수 있습니다. 순환 증폭을 통해 이러한 오류는 축적되고 증폭되어 DNA 시퀀스 복제의 충실도가 떨어집니다. 또한 DNA 중합효소는 특히 GC 함량이나 2차 구조에 큰 차이가 있는 영역의 경우 특정 증폭 편향이 있어 증폭 효율이 낮고 커버리지 균일성이 낮습니다. 잘못된 InDels를 도입하는 동안 많은 수의 복제가 발생하여 DNA 데이터 볼륨이 낭비되고 시퀀싱 비용이 증가합니다. PCR-Free 기술은 기존 라이브러리 구축에서 PCR 증폭으로 인해 발생하는 위에서 언급한 문제를 잘 피할 수 있습니다. 라이브러리 구축 및 시퀀싱 과정에서 PCR 증폭 프로세스가 있으면 게놈 커버리지 균일성에 더 큰 영향을 미칩니다. DNA 템플릿의 경우 일부는 복잡한 2차 구조를 가지고 있고 일부는 열 안정성에 큰 차이가 있습니다. 이러한 요소는 PCR 증폭의 효율성에 영향을 미칩니다. 따라서 PCR 증폭 과정에서 모든 유전체 단편이 동일한 증폭 효율을 얻을 수 있다는 보장은 없지만, 유전체의 높은 GC 또는 낮은 GC 영역에서 낮은 커버리지와 같은 명백한 증폭 편향이 있습니다. 그러나 PCR-Free 시퀀싱의 전체 과정에는 PCR이 없습니다. PCR 라이브러리 구축과 비교하여 유전체의 높은 GC 영역 및 AT/TA 반복 영역의 커버리지가 향상되었습니다. 구체적인 장점은 다음과 같습니다.

2.1 간소화된 라이브러리 준비 프로세스로 시간 절약

PCR을 사용하지 않는 라이브러리 준비는 PCR 증폭 및 기타 단계가 필요 없으므로 라이브러리 준비 프로세스가 간소화되고 시간이 절약됩니다.

2.2 라이브러리 준비 비용 절감

기존 라이브러리 제조 공정에서는 서열 진위성을 보장하기 위해 값비싼 고성능 효소를 PCR 증폭에 사용합니다. 동시에 PCR-Free는 PCR 증폭 단계를 없애 라이브러리 제조 비용을 줄입니다.

2.3 증폭 편향 감소

DNA 증폭 효소는 특히 GC 함량이나 2차 구조에 상당한 차이가 있는 템플릿의 경우 특정 증폭 편향을 갖습니다. 따라서 PCR-Free는 중합효소로 인한 증폭 편향을 효과적으로 피할 수 있습니다.

2.4 PCR 중복 없음

PCR-Free는 중복 판독을 줄이고 고유 매핑 비율과 효과적인 데이터 활용을 증가시킬 수 있습니다.

2.5 오류 감소

PCR 증폭은 삽입 및 삭제의 복제 오류를 유발할 가능성이 더 높아 인델 시퀀싱 오류율이 높아지는 반면, PCR-Free는 이러한 오류의 생성과 축적을 효과적으로 방지할 수 있습니다.

3. PCR-Free의 데이터 표시

Hieff NGS™ Ultima Pro PCR Free DNA Library Prep Kit V2 (제품번호 12196ES)는 경쟁 제품보다 라이브러리 변환율이 더 뛰어납니다.

그림 2. PCR-Free 라이브러리 구축을 위한 오프머신 시퀀싱 데이터의 양

4. 자주 묻는 질문

질문: PCR 없는 라이브러리에 적합한 샘플 유형은 무엇입니까?

답변: 복잡한 2차 구조, 높은 GC, PCR 선호도를 지닌 일부 샘플의 경우, PCR을 필요로 하지 않는 라이브러리를 선택하여 구축할 수 있습니다.

질문: PCR 없는 라이브러리의 일반적인 조각 크기는 얼마입니까?

A: PCR-free 라이브러리 자체는 단편 크기에 대한 특별한 요구 사항이 없습니다. PCR product 라이브러리, 라이브러리는 PCR product의 크기에 따라 구성됩니다. 게놈 라이브러리의 경우 라이브러리 데이터의 품질이 비교적 좋도록 약 350bp가 권장됩니다.

5. 제품 정보

Yeasen이 제공할 수 있는 제품은 표 1에 나와 있습니다.

표 1. 제품 정보

6. 독서에 관하여

DNA 샘플로부터 NGS 라이브러리 준비를 위한 솔루션

NGS 관련 기술에 대해 얼마나 알고 계신가요?