NGS 어댑터를 어떻게 선택하나요?
차세대 시퀀싱 라이브러리의 필수적인 부분인 NGS 어댑터는 테스트된 DNA 단편과 Flow cell(시퀀싱 칩)을 연결하는 역할을 합니다. 조인트의 효율성은 라이브러리의 품질과 수율을 결정하는 중요한 요소입니다. 그렇다면 NGS 어댑터란 무엇일까요? 일반적인 NGS 어댑터 유형은 무엇일까요? 그리고 시퀀싱 플랫폼에 적합한 NGS 어댑터를 선택하는 방법은 무엇일까요?
1. NGS 어댑터란 무엇인가요?
2. NGS 인덱스를 선택할 때 고려해야 할 요소는 무엇입니까?
3. 일반적인 인덱스 유형은 무엇입니까?
4. 일반적인 NGS 어댑터 유형은 무엇입니까?
- UMI 어댑터
- 완전한 어댑터
- 불완전한 어댑터
- Tn5 어댑터
5. 시퀀싱 플랫폼에 맞는 NGS 어댑터를 선택하는 방법은 무엇입니까?
6. 독서에 관하여
1. NGS 어댑터란 무엇인가요?
시퀀싱에서 일련의 어댑터인 NGS 어댑터는 알려진 시퀀스를 가진 짧은 뉴클레오타이드 시퀀스입니다. 타겟 핵산 단편의 양쪽 끝에 연결됩니다. 시퀀싱하는 동안 라이브러리를 칩에 결합하기 위해 Flow 셀에서 알려진 시퀀스와 하이브리다이징하여 시퀀싱을 시작합니다. 그렇다면 NGS 어댑터의 구조는 무엇일까요?
Illumina 플랫폼을 예로 들면, NGS 어댑터는 세 부분으로 나눌 수 있습니다.
P5 및 P7: 플로우 셀에서 P5 및 P7 말단과 결합된 시퀀스는 라이브러리를 시퀀싱 칩에 고정하여 Bridge-PCR을 통한 클러스터 반응을 용이하게 합니다.
Rd1 SP 및 Rd2 SP(Read1/Read2 시퀀싱 프라이머): 시퀀싱 프라이머의 결합 영역으로, 시퀀스가 읽히기 시작하는 위치를 나타냅니다.
인덱스(바코드라고도 함): 혼합 라이브러리의 시퀀싱에서 다양한 샘플을 구별하는 데 사용되는 알려진 합성 시퀀스입니다.
그림 1 Illumina 플랫폼 단일 인덱스 라이브러리
그림 2 MGI 플랫폼 단일 엔드 인덱스 라이브러리
시퀀싱 처리량이 증가함에 따라 여러 샘플을 동시에 시퀀싱할 수 있습니다. 따라서 다양한 샘플을 구별하는 방법이 특히 중요합니다. 앞서 언급했듯이 NGS 어댑터의 인덱스 시퀀스는 차세대 시퀀싱(NGS)에서 다양한 샘플을 구별하는 데 사용됩니다. 인덱스를 선택할 때 고려해야 할 요소는 무엇입니까? 계속 읽어주세요...
2. 인덱스를 선택할 때 어떤 요소를 고려해야 합니까?
인덱스는 일반적으로 6nt-18nt 길이이며 인덱스 수에 따라 단일 인덱스와 이중 인덱스로 나뉩니다. 이중 인덱스는 검사할 단편의 양쪽 끝에 위치합니다. 인덱스 조합을 선택할 때는 염기 균형과 형광 균형을 고려해야 합니다.
기초균형은 단일 지수의 기초균형이 아닌 여러 지수 간의 균형을 말합니다. 기초 유형과 기초 분포 모두에서 고려해야 합니다. 조합의 원칙은 동일한 지수 그룹의 네 가지 기초 A/T/C/G를 포함해야 하며, 이 네 가지 기초의 비율은 각각 약 25%로 가깝습니다.
형광 신호 균형은 염기 균형을 보장할 수 없을 때 형광 신호의 균형을 보장하기 위한 선택을 말합니다. Illumina 플랫폼의 4채널 시퀀서에서 dG/dT는 녹색 형광으로 표시되고 dC/dA는 빨간색 형광으로 표시됩니다. 시퀀싱하는 동안 성공적인 시퀀싱을 보장하기 위해 각 사이클에 녹색 및 빨간색 형광 신호가 모두 존재해야 합니다. 따라서 인덱스를 선택할 때 녹색 신호와 빨간색 신호 간의 균형을 고려해야 합니다.
3. 일반적인 인덱스 유형은 무엇입니까?
일반적인 이중 지수에는 일반적으로 UDI(Unique Dual Index), UDB(Unique Dual Barcode), CDI(Combined Dual Index)가 포함되며, 이를 통해 지수 이동과 잘못된 할당을 크게 줄일 수 있습니다.
UDI&UDB: 양 끝의 인덱스는 일대일 대응이며, 그룹으로 설계되어 양 끝에서 교차 검증이 가능합니다.
CDI: 양쪽 끝의 인덱스는 특정 요구 사항에 따라 결합되어 양쪽 끝 인덱스 라이브러리를 형성할 수 있습니다.
처리량과 증폭 효율성을 개선하고 시퀀싱 비용을 줄이기 위해 Illumina는 Novaseq 및 기타 고처리량 시퀀서에 대한 어레이 플로우 셀(PFCT) 및 배타적 증폭(ExAmp) 클러스터링 기술을 도입했지만 의도치 않게 샘플 라벨 불일치 현상과 인덱스 호핑이 증폭되었습니다.
그림 3 Illumina의 다양한 기기 모델은 비패턴화된 유동 셀 또는 패턴화된 유동 셀을 채택합니다.
HiSeq3000/4000, HiSeq X Series, NovaSeq와 같은 시퀀싱 플랫폼에서 강조되는 인덱스 후핑 문제를 보완하기 위해 Illumina는 라이브러리의 양쪽 끝에 인덱스를 두는 전략을 제안했습니다. 이를 통해 양측 검증을 수행하고 불일치 어댑터를 제거할 수 있습니다. 양쪽 끝에 고유한 인덱스를 사용하면 인덱스 오류 할당률이 0.01%로 줄어듭니다. 이전의 기존 인덱스 순열 그룹 조합 방법과 비교하면 인덱스 호핑이 두 자릿수 감소합니다.
PCR-free 라이브러리를 구축할 때, 단일 엔드 인덱스 어댑터를 사용할 수 있습니다. 라벨 불일치는 주로 시퀀싱 오류로 인해 발생합니다. 전반적으로 라벨 불일치율은 낮습니다(평균 0.0004%, 최대 0.001%). 그러나 타겟 캡처 라이브러리를 구축할 때, 여러 단계가 라벨 불일치로 이어지고 일반적으로 UDI/UDB/CDI 어댑터가 사용되기 때문에 크로스토크 문제가 증폭됩니다.
4. 일반적인 NGS 어댑터 유형은 무엇인가요?
시퀀싱 기술의 발전으로 싱글 인덱스/더블 인덱스 어댑터(섹션 3에서 언급), UMI 어댑터, 트랜스포사제 어댑터, 완전/불완전 어댑터 등 다양한 애플리케이션 시나리오에 적합한 어댑터 유형이 점점 더 많아지고 있습니다. 이 부분에서는 이러한 어댑터를 체계적으로 분류하여 어댑터 선택의 기초를 제공합니다.
4.1 UMI 어댑터
고유 분자 식별자(UMI) 어댑터는 저주파 돌연변이 탐지 및 절대 정량화를 위한 에지 도구입니다. UMI는 알려진 시퀀스를 가진 무작위 합성 시퀀스입니다. 완전히 무작위 뉴클레오타이드 사슬, 부분적 퇴화 뉴클레오타이드 사슬 또는 고정 뉴클레오타이드 사슬로 설계할 수 있습니다. 길이는 일반적으로 10nt(단일 말단 UMI) 또는 5-8nt(양말단 UMI)입니다. 그 기능은 증폭 전에 DNA 단편의 상태를 동결시키는 것이고, 각 DNA 분자는 UMI에 해당합니다. 따라서 생물정보학 분석 중에 다양한 출처의 DNA 템플릿을 구별하고, PCR 증폭 및 시퀀싱 과정에서 무작위 오류로 인해 발생한 거짓 양성 돌연변이와 환자가 실제로 가지고 있는 돌연변이를 구별하여 배경 잡음을 걸러내고 저주파 및 극히 저주파 돌연변이를 정확하게 탐지하고 다양한 DNA 분자의 절대 정량화를 수행할 수 있습니다. 저주파 돌연변이 탐지, 특히 종양 연구 분야에서 널리 사용됩니다.
그림 4 Illumina 플랫폼의 UMI 어댑터 구조의 개략도
4.2 완전한 어댑터
PCR 없는 라이브러리에 필요한 제품인 완전한 어댑터는 Illumina 플랫폼의 P5, P7, RdS1, RdS2와 같은 시퀀싱에 필요한 모든 시퀀스를 포함하고 있으며, 시퀀싱 요구 사항에 따라 인덱스 시퀀스와 UMI 시퀀스도 포함합니다. 완전한 어댑터를 사용하면 PCR을 통해 다른 어댑터를 도입하지 않고도 직접 시퀀싱할 수 있습니다. 따라서 완전한 어댑터를 사용하여 PCR 없는 라이브러리를 구축할 수 있습니다. PCR 없는 라이브러리는 PCR 증폭 편향, 오류율 및 시퀀스 중복을 줄여 인구 게놈 연구에 널리 사용되는 일부 높은 GC 또는 높은 AT 영역의 적용 범위를 늘릴 수 있습니다.
그림 5 완전한 어댑터 다이어그램
4.3 불완전한 어댑터
불완전한 어댑터는 어댑터 연결 후 PCR을 통해 다른 시퀀스를 도입하여 완전한 어댑터를 형성해야 합니다. 이들은 높은 연결 효율성과 높은 효과적인 라이브러리 속도가 특징입니다. PCR 프로세스는 효과적인 라이브러리의 농도를 보장하기 위한 완전한 라이브러리에 대한 농축 효과이며, 또한 양단 인덱스와 UMI 시퀀스를 도입할 수 있습니다.
4.4 Tn5 어댑터
Tn5 어댑터는 Tn5의 제한 효소 활동을 통해 어댑터 시퀀스의 일부를 DNA 단편의 양쪽 끝에 연결합니다. 그들은 시간과 샘플을 절약하기 위해 단편화와 어댑터 연결을 동시에 수행합니다. 마지막으로 나머지 링커 시퀀스, 인덱스, UMI 및 기타 시퀀스는 PCR에 의해 도입되어 완전한 라이브러리를 형성합니다. 이를 사용하여 Cut&tag 라이브러리를 구축할 수 있습니다.
그림 6 Tn5 어댑터 라이브러리 구축의 개략도
5. 시퀀싱 플랫폼에 맞는 NGS 어댑터를 선택하는 방법은 무엇입니까?
현재 Illumina와 MGI를 포함한 두 가지 주류 시퀀싱 플랫폼이 있습니다. NGS 공급업체를 위한 완벽한 솔루션인
Illumina 플랫폼 측면에서
완전한 UDI NGS 어댑터는 커플링 문제에 대해 걱정할 필요가 없으므로 사용하기 쉬운 것을 원하는 고객에게 적합합니다. CDI NGS 어댑터는 튜브가 적고 크기가 작아 보관과 휴대를 쉽게 원하는 고객에게 적합합니다. PCR-free는 완전한 NGS 어댑터를 사용해야 합니다.
일루미나를 위해
| 인튜브 | Illumina용 Hieff NGS ® D NA Lib Prep 384 CDI 프라이머, 세트 1(8*12, 96 인덱스) | 12412ES |
| Illumina용 Hieff NGS ® D NA Lib Prep 384 CDI 프라이머, 세트 2(8*12, 96 인덱스) | 12413ES | |
| Illumina용 Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI 프라이머, 세트 1(96 인덱스) | 12414ES | |
| Illumina용 Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI 프라이머, 세트 1(96 인덱스) | 12415ES | |
| 플레이트에서 | Illumina용 Hieff NGS® Stubby UDI 프라이머 키트(1-384 지수) 세트 1-4 | 12407ES |
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Illumina용 Hieff NGS® Stubby UDI 프라이머 키트 Set1 （ 96 well Plate, 1-96 Index ） Set 1 |
12327ES | |
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Illumina용 Hieff NGS® Stubby UDI 프라이머 키트 Set2 （ 96 well Plate, 97-192 Index ） Set 2 |
12328ES | |
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Illumina용 Hieff NGS® Stubby UDI 프라이머 키트 Set3 （ 96 well Plate, 193-288 Index ） Set 3 |
12329ES | |
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Illumina용 Hieff NGS® Stubby UDI 프라이머 키트 Set4 （ 96 well Plate, 289-384 Index ） Set 4 |
12330ES |
MGI를 위해
| MGI용 Hieff NGS™ 듀얼 UMI UDB 어댑터 키트, Set1/Set2 | 96가지 종류의 인덱스 | |
| MGI용 Hieff NGS™ 완전 어댑터 키트, Set1/Set2/Set3(문의) | 13360ES | 8가지 종류의 인덱스, 41-48 |
| 13361ES | 16가지 종류의 인덱스, 57-72 | |
| 13362ES | 96가지 종류의 인덱스, 1-96 |
독서에 관하여
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NGS의 다양한 종류의 자기 비드: DNA\RNA\mRNA 자기 비드
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