Western Blot 워크플로에서 흔히 발생하는 실수 방지

I. Western Blot의 원리

웨스턴 블롯(WB) 또는 단백질 면역 블로팅은 항원-항체 상호작용을 기반으로 특정 단백질을 검출하는 고전적인 기술로, 분자 생물학, 면역학 및 관련 분야에서 널리 사용됩니다. 핵심 단계는 다음과 같습니다.

단백질 분리 :

- SDS-PAGE는 변성된 단백질을 분자량에 따라 분리합니다.

- SDS는 단백질을 균일한 음전하로 코팅하여 구조적 영향을 제거합니다.

멤브레인 전이 :

- 단백질은 겔에서 막(예: PVDF 또는 니트로셀룰로오스)으로 이동합니다.

항체 검출 :

- 1차 항체는 표적 단백질에 특이적으로 결합한 다음, 효소와 결합된 2차 항체(예: HRP)가 화학 발광과 같은 검출 가능한 신호를 생성합니다.

II. 표준 Western Blot 워크플로

단계	주요 절차	추천 시약 (예센제품)
1. 샘플 준비	RIPA 용해 완충액으로 단백질을 추출하고, PMSF를 첨가하여 프로테아제 활동을 억제합니다 .	RIPA Lysis Buffer 시리즈, PMSF
2. 단백질 정량	정량화에는 BCA 방법( Cat#20200ES )을 사용합니다. 표준 희석 완충액과 샘플 완충액을 일치시킵니다.	BCA 정량화 키트( Cat#20200ES / 20201ES )
3. SDS-PAGE 전기영동	미리 주조된 젤을 사용하고 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 150V에서 작동시킵니다.	사전 주조 젤, SDS-PAGE 로딩 버퍼
4. 멤브레인 전달 및 차단	PVDF 멤브레인 활성화 ( Cat#36125ES ) 메탄올에 1분간 담가두었다가 얼음물 욕조에서 300 mA로 60분간 옮긴다. 실온(RT)에서 1시간 동안 차단하거나 빠른 차단 용액( Cat#36122ES )을 10분간 사용한다.	트랜스퍼 버퍼, PVDF 멤브레인 시리즈
5. 항체 배양	1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하고, 2차 항체는 실온에서 1~2시간 배양하고, TBST로 3번 철저히 씻어냅니다.	항체 희석제
6. 단백질 검출	ECL( Cat#36208ES )을 사용하여 개발하세요.	ECL 화학 발광 시리즈

그림 1: Western Blot 워크플로

III. 일반적인 문제 및 해결책

문제	가능한 원인	솔루션
높은 배경	차단이 완료되지 않음	새로운 차단 솔루션을 사용하고 차단 시간을 연장하세요 .
	세척이 불충분하다	비특이적 결합을 제거하려면 세척 빈도와 시간을 늘립니다.
	과도한 1차 항체 농도	항체를 적절한 농도로 희석합니다.
	샘플 품질 문제	샘플의 순도와 품질을 확인하고 신선한 샘플을 사용하세요.
	멤브레인 건조	배양 단계 동안 멤브레인이 수분을 유지하도록 하고, 반응 용액과의 완전한 접촉을 보장합니다.
신호가 약하거나 없음	전송이 완료되지 않았습니다	전송 효율성을 확인하고 필요에 따라 시간을 조정하세요.
	활성화되지 않은 PVDF 멤브레인	완충액으로 옮기기 전에 PVDF를 메탄올에 담가 활성화시킵니다.
	표적 종과 1차 항체 불일치	데이터시트를 확인하고 면역원과 단백질 서열을 비교하고 다음을 포함합니다. 널리 사용되는 양성 대조군(예: 포유류 세포의 β-액틴).
	1차 및 2차 항체 비호환성	2차 항체가 1차 항체의 숙주 종과 일치하는지 확인하세요.
	항체 결합이 부족합니다	항체 농도를 높이고 4°C에서 배양 시간을 연장합니다(예: 밤새).
	항원 수치가 낮음	각 레인에 최소 20-30μg의 단백질을 적재하고, 프로테아제 억제제와 양성 대조군을 사용합니다.
	낮은 표적 단백질 발현	문헌/데이터베이스를 통해 샘플의 발현을 확인합니다. 샘플을 농축하거나 고발현 대조군을 사용합니다.
비특정 밴드/다중 밴드	단백질 프로필을 변경하는 과다 통과 세포주	저계대 세포(<15 계대)를 사용하고 조기 계대 스톡과 병행 대조군을 실행합니다.
	단백질 분해	용해 완충액에 프로테아제 억제제를 포함시키고, -80°C에서 보관하고, 동결-해동을 피하고, 신선한 샘플을 사용하세요.
	번역 후 수정	밴드 크기에 영향을 미치는 변형(예: 유비퀴틴화, 글리코실화)에 대한 문헌을 확인하세요.
	다양한 스플라이스 변형	문헌이나 데이터베이스를 통해 스플라이스 변형을 확인합니다.
	단백질 다이머/멀티머	SDS 로딩 버퍼에 신선한 β-머캅토에탄올이나 DTT를 첨가합니다.
	외인성 단백질 오염	외인성 단백질을 확인하고, 필요한 경우 세포주를 전환합니다.
	과도한 샘플 로딩	기울기 테스트를 통해 표적 발현에 따라 로딩(20-30 μg)을 최적화합니다.
	멀티머 형성	샘플을 10분간 끓여서 다중체를 분리합니다.
	높은 1차 항체 농도	추가 밴드가 생성되는 것을 방지하려면 농도 및/또는 배양 시간을 줄이세요.
	높은 2차 항체 농도	농도를 낮추고 비특이적 결합을 줄이기 위해 2차 전용 제어를 포함합니다.
	보고되지 않은 단백질 또는 패밀리 멤버 감지	문헌이나 BLAST를 검토하고, 추천되는 세포주/조직을 사용하세요.
	보고되지 않은 단백질 또는 패밀리 멤버 감지	검증이 되면, 새로운 단백질을 발견했을지도 몰라요!
미소 짓는 밴드	빠른 마이그레이션, 높은 버퍼 온도, 과부하, 낮은 버퍼	이동을 느리게 하고, 완충액을 예냉하고, 단백질 부하를 줄이고, 완충액이 웰을 완전히 덮는지 확인합니다.
찡그린 얼굴 밴드	장치 문제(예: 젤 아래에 거품이 생김)	거품을 제거하고 균일한 젤 중합을 보장하기 위해 설정을 조정하세요.
꼬리띠	샘플 용해도 불량, 분해, 완충액 재사용	샘플을 잘 섞은 후, 새로운 샘플을 사용하고, 새로운 러닝 버퍼를 준비합니다.
덤벨 모양 밴드	고르지 않은 젤 중합, 불순한 샘플	균일성을 위해 겔을 다시 주조하고, 사용 전에 샘플을 원심분리합니다.
밴드 번짐	과도한 로딩, 젤 품질이 좋지 않음	샘플 용량을 줄이고, 겔 제조를 개선합니다.
거품 자국	이송 중에 공기가 갇힘	샌드위치를 조립할 때 거품을 제거하세요.
고르지 않은 검은 반점	용해되지 않은 차단용액, 항체분포 불균일	차단용액을 완전히 녹인 후, TBST로 3번 씻어내고, 배양하는 동안 교반합니다.
흰색 패치	높은 항체 농도로 인한 기질 고갈	1차/2차 항체 농도가 낮습니다.

4. 제품 선택 및 최적화 도구

Yeasen은 귀하의 작업 흐름을 간소화하기 위한 포괄적인 시약 제품군을 제공합니다.

관련 상품:

절차	카탈로그 번호	제품 이름	명세서
샘플 준비	20101ES	RIPA 용해 완충액(강함)	100ml
	20115ES	RIPA 용해 완충액(중간)	100ml
	20114ES	RIPA 용해 완충액(약함)	100ml
	20118ES	WB/IP 분석을 위한 용해 완충액	100ml
	20201ES	BCA 단백질 정량화 키트(향상된)	500T/2500T/5000T
	20200ES	BCA 단백질 정량 키트(사용 가능)	500톤
SDS-PAGE 전기영동	20350ES	골드 밴드 플러스 3색 일반 범위 단백질 마커(8-180 kDa)	250 μL/2×250 μL/10×250 μL
	20352ES	GoldBand™ 3색 고범위 단백질 마커(10-245 KDa)	2×250μL/10×250μL
	20328ES	SDS-PAGE 겔 준비 키트	1키트(30~50개 젤)/ 1키트(150~250개 젤)
	20324ES - 20327ES	PAGE 젤 퀵 준비 키트	농도 : 8%、10%、12.5%、15%
	36259ES-36280ES	프리캐스트 단백질 플러스 젤	농도 : 8%、10%、12%、4-12%、4-20% 웰 로딩 옵션: 10개 웰、12개 웰、15개 웰
멤브레인 전이 및 차단	36125ES	0.45 μm PVDF 멤브레인(1롤, 30cm×3 m)	1 롤
멤브레인 전이 및 차단	36126ES	0.22 μm PVDF 멤브레인(1롤, 30cm×3 m)	1 롤
항체 배양	36206ES	WB용 1차 및 2차 항체 희석제	100ml/500ml
단백질 검출	36208ES	슈퍼 ECL 검출 시약	100ml/500ml
단백질 검출	36222ES	강화된 ECL 화학 발광 기질 키트	100ml/500ml

V. 지원을 받는 방법

개인화된 문제 해결 또는 프로토콜 최적화의 경우:

방문: Yeasen Western Blot 제품 페이지
이메일: info@yeasenbio.com

성공을 위한 황금률: 표준화된 절차 + 고품질 시약 + 단계별 검증 = 재현 가능한 WB 결과!

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