HEK293 숙주 세포 잔류 DNA 단편 분석 키트는 생물학적 제제의 중간체, 반제품 및 최종 제품에서 다양한 길이의 HEK293 잔류 DNA 단편을 정량적으로 분석하도록 설계되었습니다. 이 키트는 qPCR 형광 프로브 원리를 활용하여 200개 염기쌍 이하와 초과 모두의 HEK293 DNA 잔류물을 특이적이고 빠르게 검출하며, 정량 한계는 10 fg/μL로 낮습니다. 또한 HEK293 DNA Control(DNA 정량 참조)도 포함되어 있습니다. 이 키트는 회사의 자기 비드 기반 잔류 DNA 샘플 준비 키트( Cat#18461ES /18462ES)와 함께 사용할 수 있습니다.

제품 정보

요소

보관 및 배송:

1. 모든 구성 요소는 드라이 아이스에 담겨 배송되며 수령 시 -25°C ~ -15°C에서 보관해야 합니다. 유통기한은 2년입니다. 구성 요소 A 및 B1, B2, B3, B4는 빛으로부터 보호하여 보관해야 합니다.

2. 제품을 받으면 7가지 구성품이 모두 있는지 확인하고 권장 온도에서 즉시 보관하세요.

지침:

1. 본 제품은 연구 목적으로만 사용됩니다.

2. 안전과 건강을 위해 작업 중에는 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용하세요.

3. 이 시약을 사용하기 전에 사용 설명서를 주의 깊게 읽으십시오. 실험은 샘플 취급, 반응 혼합물 준비, 피펫팅을 포함한 표준 절차에 따라 수행해야 합니다.

4. 각 성분을 가볍게 흔들어 완전히 섞은 후, 사용하기 전에 잠깐 원심분리해야 합니다.

호환 가능한 악기:

다음 악기를 포함하되 이에 국한되지 않음: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus , Bio-Rad: CFX96 Optic Module , Shanghai Hongshi Medical Technology: SLAN-96S

사용 설명서

 1. HEK293 DNA Control 정량 참조 희석 및 표준 곡선 작성

HEK293 단편 분석 키트에는 82bp, 133bp, 227bp, 515bp의 길이가 다른 4개의 증폭 단편이 포함되어 있습니다. 표준 곡선을 설정할 때 각 증폭 단편에 대해 별도의 곡선을 설정하고 해당 표준 곡선을 기반으로 잔류량과 상대적 분포를 계산합니다.

키트에 제공된 DNA 희석 완충액을 사용하여 HEK293 DNA Control Quantitative Reference의 기울기 희석을 수행합니다. 희석 농도는 다음과 같아야 합니다: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 및 30 fg/μL .

자세한 내용은 다음과 같습니다.

1 ) . 키트의 HEK293 DNA Control 및 DNA Dilution Buffer를 얼음 위에 두고 해동합니다. 완전히 해동한 후 가볍게 흔들어 섞고 잠시 원심분리(10초)하여 튜브 바닥에 용액을 모읍니다.

2 ) . 깨끗한 1.5 mL 원심분리관 6개를 준비하고 각각 Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5로 라벨을 붙입니다.

3 ) Std0라고 표시된 튜브에 DNA 희석 완충액 90 μL와 HEK293 DNA 대조군 10 μL를 넣어 농도를 3 ng/μL로 만듭니다. 부드럽게 흔들어 섞은 후 잠깐 원심분리합니다(10초). 이 농도는 분주하여 단기 사용(최대 3개월)을 위해 -20°C에 보관할 수 있습니다. 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오.

4 ) Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5로 라벨이 붙은 튜브에 먼저 각각에 DNA 희석 완충액 90 μL를 첨가합니다. 각 희석 단계는 부드럽게 혼합하고 균일성을 보장하기 위해 잠시 원심분리해야 합니다. 그런 다음 그래디언트를 수행합니다. 희석은 다음과 같습니다.

표 1: 표준 기울기 희석

* 각 농도에 대해 3회 반복합니다. 이 시약은 300 pg/μL~30 fg/μL의 선형 범위 내에서 테스트할 수 있습니다. 필요한 경우 선형 범위를 적절히 확장하거나 좁힐 수 있습니다.

** 반복적인 동결-해동 주기를 줄이고 오염을 피하기 위해, 첫 번째 사용 시에는 DNA 정량 표준품을 분주하여 -20°C에서 보관 하는 것이 좋습니다 .

*** 사용하지 않은 해동 DNA 희석액은 2-8°C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다. 장기간 사용하지 않을 경우 -20°C에서 보관하세요.

**** 템플릿이 완전히 섞이도록 각 그라데이션 희석액을 약 1분 동안 가볍게 흔듭니다.

2. 시험 시료(TS) 준비

다음과 같이 실험 설정에 따라 시험 샘플 TS를 준비합니다.

1) 시험 샘플 100 μL를 취하여 1.5 mL 깨끗한 원심분리 튜브에 넣습니다. TS로 표시하고 샘플 전처리를 수행한 후 시험 샘플을 정제 할 준비를 합니다 .

2) 4가지 다른 연장 길이를 동시에 분석하기 위한 요건을 충족하기 위해, 전처리된 시험 샘플의 양은 ≥120 μL이어야 합니다. 따라서 전처리를 위해 각 샘플의 튜브를 2개씩 준비하고, 추출 후 사용하기 위해 함께 혼합하는 것이 좋습니다.

3. 음성 추출 대조군(NCS) 준비

다음과 같이 실험 설정에 따라 음성 추출 제어 NCS를 준비합니다.

1) 샘플 매트릭스 용액(또는 DNA 희석 완충액 ) 100 μL를 취하여 1.5 mL 깨끗한 원심분리 튜브에 넣습니다. NCS로 라벨을 붙입니다.

2) 음성 대조군 NCS에 대한 샘플 전처리를 시험 샘플 배치와 함께 수행하고 정제된 음성 대조군 NCS 용액을 준비합니다.

3) 4가지 다른 연장 길이를 동시에 분석하기 위한 요건을 충족하기 위해, 전처리된 NCS 샘플의 양은 ≥120 μL이어야 합니다. 따라서 전처리를 위해 각 NCS 샘플의 튜브 2개를 준비하고, 추출 후 사용을 위해 함께 혼합하는 것이 좋습니다.

4. 템플릿이 없는 대조군(NTC) 준비

다음과 같이 실험 설정에 따라 템플릿이 없는 제어 NTC를 준비합니다.

1) No Template Control(NTC)은 검체 전처리가 필요 없으며 , qPCR을 이용하여 잔류 DNA 함량을 검출하는 단계부터 준비할 수 있습니다.

2) 각 튜브 또는 웰에 대해 NTC 샘플은 20 μL의 혼합물(즉, 15 μL HEK293 qPCR 혼합물 + 5 μL 해당 HEK293 프라이머 및 프로브 혼합물) + 10 μL DNA 희석 완충액으로 구성됩니다. 3개의 복제 웰에 충분한 양을 준비하는 것이 좋습니다.

5. qPCR 반응 시스템

표 2 . 82 bp 단편 에 대한 반응 시스템

표 3 . 133 bp 단편 에 대한 반응 시스템

표 4 . 2 2 7 bp 단편 에 대한 반응 시스템

표 5 . 515 bp 단편 에 대한 반응 시스템

* 이 반응에 필요한 총 혼합물 양을 웰 수에 따라 계산하려면 다음과 같습니다.

혼합 = (반응 웰 수 + 2) × (15 + 5) μL (2개 웰의 손실을 고려). 일반적으로 각 샘플에 대해 3개의 복제 웰을 준비합니다.

** 반응 웰 수 = (농도 구배 표준 곡선 웰 5개 + 템플릿 없는 대조군(NTC) 1개 + 음성 대조군 용액(NCS) 1개 + 시험 샘플(TS) N개) × 3.

NTC(No Template Control): DNA 희석 완충액

NCS (음성 대조 용액): 시료 전처리 후, 정제된 용액인 시료 매트릭스 용액 또는 DNA 희석 완충액 , 즉 NCS입니다.

TS (테스트 샘플): 테스트할 샘플.

***샘플을 분주하고 튜브를 밀봉한 후, 저속(10초)으로 잠깐 원심분리하여 튜브 벽에서 바닥까지 액체를 모은다. 그런 다음 최소 5초 동안 vortex하여 완전히 섞는다. 그런 다음, 다시 저속 원심분리(10초)를 수행한다. 거품이 있으면 제거한다.

표 6: 참조 플레이트 레이아웃

이 예에서는 잔류 HEK293 DNA의 증폭 단편을 분석하기 위한 qPCR 검출 절차를 보여줍니다 . 테스트 샘플에는 HEK293 DNA 표준 곡선의 농도 구배 5개, 테스트 샘플(TS), 음성 대조군 용액(NCS) 1개, 템플릿 없는 대조군(NTC) 1개가 포함됩니다. 각 샘플에 대해 3개의 복제 웰을 실행하는 것이 좋습니다.

6. 증폭 프로그램 매개변수(3 단계 방법) (ABI 7500 qPCR 기기, 소프트웨어 버전 2.0 사용 예)**

1) 새 빈 프로그램을 만들고 탐지 템플릿으로 "절대 정량화"를 선택합니다.

2) 네 가지 다른 증폭 단편 길이에 대해 새로운 검출 프로브를 만들고 "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227", "HEK293-515"라는 이름을 붙입니다. 리포터 형광체를 "FAM"으로 선택하고 퀀처 형광체를 "없음"으로 선택합니다. 검출을 위한 참조 염료를 "ROX"로 설정합니다(참조 염료는 기기 모델 및 기타 요인에 따라 추가되거나 추가되지 않을 수 있음).

3) "선택한 웰에 대상 할당" 패널에서 표준 곡선 웰의 "작업" 필드를 "표준"으로 설정하고 "수량" 필드의 해당 값을 "300000", "30000", "3000", "300", "30"(웰당 DNA 농도를 fg/μL로 나타냄)으로 지정합니다. "샘플 이름" 필드의 웰 이름을 "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL"로 지정합니다. NTC 웰의 경우 "작업"을 "NTC"로 설정합니다. NCS 및 TS 웰의 경우 "작업"을 "알 수 없음"으로 설정하고 "샘플 이름" 필드에서 웰 이름을 "NCS" 및 "TS"로 지정합니다. 이러한 매개변수를 설정한 후 "실행 시작"을 클릭하여 계측 실행을 시작하세요.

4) 증폭 프로그램 설정: 반응 용량을 30 μL로 하여 3단계 증폭 프로그램을 설정합니다.

표 7. PCR 절차

7. qPCR 결과 분석

1) "Amplification Plot" 아래의 "Analysis" 패널에서 시스템은 자동으로 "Threshold"를 설정합니다. 기본 "Threshold"가 기준선에 너무 가까워서 반복 실험 간에 상당한 Ct 변동이 발생하는 경우가 있습니다. "Threshold"를 적절한 위치로 수동으로 조정하고 "Analyze"를 클릭할 수 있습니다. 이 시점에서 "Multicomponent Plot"에서 증폭 곡선을 미리 확인하여 정상인지 확인할 수 있습니다.

2) "표준 곡선" 아래의 "분석" 패널에서 표준 곡선의 R², 증폭 효율(Eff%), 기울기, 절편을 읽을 수 있습니다. 정상적인 표준 곡선의 경우: R² > 0.99, 증폭 효율(90% ≤ Eff% ≤ 110%), 기울기 -3.6과 -3.1 사이입니다.

3) "View well table" 아래의 "Analysis" 패널에서 무템플릿 대조군(NTC), 음성 대조군(NCS), 시험 샘플(TS)에 대한 "Quantity" 열을 읽을 수 있으며, 단위는 fg/μL입니다. 이 단위는 보고서에서 나중에 변환할 수 있습니다.

4) 결과 분석을 위한 매개변수 설정은 특정 기기 모델과 소프트웨어 버전에 따라 달라야 합니다. 일반적으로 기기는 결과를 자동으로 해석할 수 있습니다.

5) 음성 대조군(NCS)의 Ct 값은 표준 곡선의 가장 낮은 농도의 평균 Ct 값보다 커야 합니다.

6) 템플릿 없는 대조군(NTC)의 결과는 "미정"이거나 Ct 값이 ≥ 32여야 합니다.

문서

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