Mycoplasma, ook bekend als pleuropneumonie-achtige organismen (PPLO), zijn de kleinste en eenvoudigste prokaryoten die tot nu toe zijn ontdekt en die geen celwand hebben. Ze hebben een diameter van 0,1 tot 0,3 μm, kunnen door filters heen en vertonen een hoog pleomorfisme. Ze zijn relatief veelvoorkomende en moeilijk te detecteren bacteriële verontreinigingen in zoogdiercelculturen
Mycoplasma-besmetting heeft meerdere nadelige effecten op celculturen en is een serieus probleem geworden in celcultuurpraktijken. Er wordt conservatief geschat dat de mycoplasma-besmettingsgraad in routinematige celculturen varieert van 15% tot 35%, wat de geloofwaardigheid van de experimentele resultaten ernstig verstoort.
Ongeveer 95% van de mycoplasma-besmetting in celculturen wordt voornamelijk veroorzaakt door Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis en Mycoplasma hyorhinis. Op kweekmedia vormen mycoplasma-kolonies een 'gebakken-ei'-uiterlijk. Celcultuursupernatanten en celmembranen bieden een geschikte omgeving voor mycoplasma-groei en mycoplasma's die het oppervlak van cellen parasiteren, kunnen het gastheercelmembraan binnendringen.
De belangrijkste bronnen van mycoplasmabesmetting zijn: celkweekmedia of componenten daarvan (zoals grondstoffen voor het medium, serum en andere reagentia), laboratoriumpersoneel, celkweekincubators, opslagtanks voor vloeibare stikstof, zwevende deeltjes en aerosolen, overmatig gebruik van antibiotica, niet goed afgesloten celkweken en cellen die al besmet zijn met mycoplasma.
De bijbehorende gevaren van deze besmettingen zijn onder meer: het kan leiden tot het schrappen van partijen celproducten of producten die zijn geproduceerd met cellen als medium, omdat mycoplasma niet effectief kan worden verwijderd tijdens de verdere zuivering; het kan alle gerelateerde apparatuur en faciliteiten besmetten, evenals tussenproducten of eindproducten die in contact komen met het besmette materiaal; het kan ervoor zorgen dat andere normale cellen besmet raken met mycoplasma; het kan leiden tot het schrappen van belangrijke cel- of viruszaadbanken vanwege mycoplasmabesmetting; het kan het laboratorium dwingen de productie of experimentele activiteiten te staken om de mycoplasmabesmetting aan te pakken; het kan leiden tot de ontwikkeling van mycoplasmaresistentie, waardoor het nog moeilijker wordt om deze te elimineren; het kan het gebied van mycoplasmabesmetting vergroten; en het kan een bedreiging vormen voor andere celculturen in het laboratorium.
Daarom is het belangrijk om regelmatig mycoplasma te testen en te verwijderen om er zeker van te zijn dat er geen mycoplasma aanwezig is in het celkweeksysteem. Dit is essentieel voor de normale voortgang van wetenschappelijk onderzoek.
Mycoplasma Detectie
Mycoplasma is een relatief veelvoorkomend, maar doorgaans moeilijk te verwijderen type contaminatie. Voor biologische processen waarbij celkweek betrokken is, vereisen de voorschriften dat 'er geen mycoplasma-contaminatie mag zijn.'
- In de editie 2020 van de Chinese Farmacopee, deel III, 'Voorbereiding en kwaliteitscontrole van dierlijke celsubstraten voor de productie en het testen van biologische producten', staat dat voor cellen die in de productie worden gebruikt, mycoplasmatesten moeten worden uitgevoerd op de Master Cell Bank (MCB), Working Cell Bank (WCB) en End-of-Production Cells (EOPC).
- FDA, Richtlijn voor de industrie: Karakterisering en kwalificatie van celsubstraten en andere biologische materialen die worden gebruikt bij de productie van virale vaccins voor indicaties van infectieziekten, bepaalt dat mycoplasmabestrijding moet worden uitgevoerd op grondstoffen, viruszaden, onverwerkte oogstvloeistoffen en andere dergelijke materialen.
- In ICH Q5D, 'Afleiding en karakterisering van celsubstraten die worden gebruikt voor de productie van biotechnologische/biologische producten', wordt ook vermeld dat mycoplasmabestrijding moet worden uitgevoerd op grondstoffen, viruszaden, onverwerkte oogstvloeistoffen en dergelijke materialen.
Figuur 1 Testpunten voor besmetting met mycoplasma die vereist zijn door nationale en internationale regelgeving
Traditionele mycoplasmadetectiemethoden omvatten voornamelijk kweekmethoden en indicatorcelmethoden. Vanwege de lange detectiecycli of gevoeligheidsproblemen van deze twee methoden leiden ze echter tot langere productie- of productreleasecycli voor ondernemingen. Met de ontwikkeling van cel- en gentherapie zijn de eisen van de industrie voor de tijdigheid en gevoeligheid van mycoplasmadetectie steeds strenger geworden. Korte houdbaarheidsdata zijn onvoldoende om dergelijke lange detectieperioden te ondersteunen, wat de reden is dat de snelle NAT-methode (Nucleic Acid Testing) zich onderscheidt van verschillende mycoplasmadetectiemethoden.
Figuur 2 Mycoplasma-detectiemethoden vermeld in nationale en internationale regelgeving
Gebaseerd op NAT (nucleïnezuur amplificatietechnieken),
Het is een product voor de snelle kwalitatieve detectie van potentiële mycoplasma-verontreiniging in productiegrondstoffen, celbanken, virale zaden, virale of celoogstvloeistoffen en therapeutische cellen. Het wordt voornamelijk gebruikt in de onderzoeks-, ontwikkelings-, productie- en vrijgaveprocessen van biofarmaceutica.
Productkwalificaties
Naleving van regelgeving: Gevalideerd volgens de vereisten van de farmacopees EP2.6.7, JP G3 en USP 63 en voldoet aan de normen van gezaghebbende internationale organisaties.
Auditnaleving: De productproductie voldoet aan de ISO13485-normen voor kwaliteitsmanagementsystemen en wordt ondersteund door uitgebreide auditdocumentatie.
Kwaliteitsborging: Alle voor de kit benodigde enzymgrondstoffen worden door ons zelf geproduceerd en zijn geïndustrialiseerd, waardoor een stabiele levering is gewaarborgd.
Technische ervaring opbouwen: De TaqMan-methode heeft een solide technische basis en de kitgevoeligheid kan 10 CFU/ml en lager bereiken.
Focus op productprestaties: De Taq-enzymantilichaambibliotheek met dubbelblokkerende antilichamen verbetert de specificiteit, gevoeligheid en stabiliteit van de kit.
Producteigenschappen
Meerdere detectietypen: Geoptimaliseerde TaqMan-sondes kunnen maximaal 183 mycoplasma-soorten detecteren.
Eenvoudig te gebruiken: De totale tijd voor het voorbereiden en testen van het monster bedraagt minder dan 3 uur. Hierdoor vervalt de wachttijd van 28 dagen die gepaard gaat met kweekmethoden.
Hoge gevoeligheid: De detectielimiet bedraagt slechts 10 CFU/ml, waardoor het een goed alternatief is voor directe kweekmethoden.
Hoge specificiteit: Primers en probes zijn ontworpen voor 16S rRNA, waardoor kruisreacties met nauw verwante soorten zoals clostridia en lactobacillen worden voorkomen.
Hoge veiligheid: De positieve controle (PC) in de kit is niet-infectieus, waardoor het risico op besmetting volledig wordt uitgesloten.
Sterke interferentieweerstand: Door een interne controle (IC) in te voeren, worden storingen en afwijkingen in de reactiebereiding uitgesloten. Zo worden vals-negatieve resultaten effectief vermeden.
Figuur 3 Workflow voor Mycoplasma-detectie met behulp van de Mycoplasma Real-time qPCR-detectiekit
2.MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detectie KitHet maakt gebruik van een unieke isothermische versterkingstechnologie, die een hogere kleuronderscheiding biedt. De verandering van blauwviolet (negatief) naar hemelsblauw (positief) is gemakkelijker te onderscheiden met het blote oog. Bovendien bevat het anti-besmettingscomponenten om het optreden van vals-positieve resultaten te elimineren.
Figuur 4: Bedieningsprocedure voor mycoplasmadetectie met behulp van de MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit
3.GMyc-PCR-mycoplasma DetectieUitrustingIn tegenstelling tot conventionele one-step PCR-detectiemethoden, wordt het aantal primers verhoogd van één paar naar drie paren, gericht op de geconserveerde regio's van mycoplasma 16S en 23S rRNA voor geneste PCR-amplificatie. Dit vermindert niet alleen niet-specifieke producten, maar verbetert ook aanzienlijk de gevoeligheid van het product, waardoor de detectie van slechts één kopie van mycoplasma mogelijk is.
、
Figuur 5 Bedieningsprocedure voor mycoplasmadetectie met behulp van de GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit
Verwijdering van mycoplasma
Tijdens het celkweekproces kan regelmatig testen effectief grootschalige mycoplasma-besmetting voorkomen. Als de cellen echter al besmet zijn met mycoplasma, moeten ze snel worden behandeld. De beste manier is om de besmette cellen onder hoge druk te steriliseren en ze vervolgens weg te gooien om besmetting van andere schone cellijnen te voorkomen. Als de besmette cellen bijzonder waardevol zijn en het nodig is om de mycoplasma-besmetting te verwijderen, kan een combinatie van antibiotica worden gebruikt om dit doel te bereiken. Omdat mycoplasma's geen celwand hebben, zijn traditionele antibiotica over het algemeen niet effectief tegen hen. Daarom is het selecteren van een geschikt mycoplasma-verwijderingsreagens cruciaal.
Producteigenschappen
Lage toxiciteit: Minimale toxiciteit voor cellen, waardoor er geen verstoring optreedt van daaropvolgende celexperimenten, zoals transfectie- en levensvatbaarheidstests.
Hoge stabiliteit: Het reagens kan gedurende lange tijd bij -20°C worden bewaard en behoudt daarbij zijn hoge werkzaamheid.
Eenvoudig te gebruiken: Voeg het product eenvoudig toe aan het met mycoplasma besmette kweekmedium en laat het incuberen.
Snelwerkend: 'Onmiddellijke resultaten', de effecten zijn al binnen 3 dagen zichtbaar.
Breed spectrum: Kan de meeste mycoplasmatypen verwijderen die in laboratoria voorkomen.
Figuur 6.Illustratie van de cytotoxiciteitstest voor het verwijderen van mycoplasma-reagens
Mycoplasma-preventie
In het proces van celkweek treedt vaak mycoplasma-besmetting op. Vanwege de unieke eigenschappen is het echter moeilijk om het met het blote oog of microscopische apparatuur te detecteren. Daarom is het bijzonder belangrijk om goed werk te leveren in mycoplasma-preventie. Effectieve preventie van mycoplasma-besmetting kan worden bereikt door mycoplasma-preventiereagentia aan het kweekmedium toe te voegen.
Momenteel is mycoplasma in laboratoria voornamelijk afkomstig van: kruisbesmetting tussen cellen, besmetting van de werkomgeving of laboratoriumapparatuur, slechte aseptische technieken door experimentatoren, besmette kweekmedia of reagentia en originele weefsels of organen met mycoplasmabesmetting. De mycoplasmapreventieproductserie die is ontwikkeld door
Productinformatie
| Product | Catalogusnummer | Productnaam | productspecificatie |
| Voorbeeld voorbehandelingskit | 18461ES | 25T/100T | |
| 18467ES | MolPure® Mag48 Monstervoorbereidingskit FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Instrument voor extractie van nucleïnezuur | 80511ES | 48-kanaals geautomatiseerde extractor voor nucleïnezuur | 48 Kanaal |
|
Mycoplasma-detectiekit | 40619ES | MycAway® Mycoplasma Real-time qPCR Detectiekit (2G)
| 25T/100T |
| 40612ES | 25T/100T | ||
| 40601ES | 10 proeven/20 proeven | ||
| Mycoplasma-verwijderingsreagens | 40607ES | MijnCawayTM Behandeling (1000×) - Mycoplasma-verwijderingsreagens | 1 ml/5×1 ml
|
|
Mycoplasma Preventie Reagens | 40608ES | MijnCawayTM Profylactisch (2000×) - Mycoplasma Preventie Reagens | 1 ml/5×1 ml
|
| 40605ES | MijnCawayTM Spray (Klaar voor gebruik) | 500 ml/2 × 500 ml/10 × 500 ml
| |
| 40609ES | MijnBewakerTM-1 Oplossing (100×), voor het desinfecteren van het waterbad van de CO2-incubator | 100 ml | |
| 40610ES | MijnBewakerTM-2 Oplossing (500×), voor het desinfecteren van een gewoon waterbad | 100 ml |