De afgelopen jaren, met de snelle ontwikkeling van biomedische technologie, de opkomst van cel- en gentherapieën tijdens de COVID-19-pandemie en de komst van mRNA-vaccins, is het waarborgen van de veiligheid en betrouwbaarheid van biologische producten een aandachtspunt geworden voor overheden en regelgevende instanties wereldwijd. Mycoplasma-besmetting is een veelvoorkomend maar doorgaans lastig type besmetting om te elimineren. Regelgevende vereisten schrijven voor dat er "geen mycoplasma-besmetting" moet worden gewaarborgd voor bioprocessen waarbij celkweek is betrokken.
Vereisten van regelgevende instanties voor mycoplasma-testen:
- De FDA's "Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications" schrijft voor dat grondstoffen, virale zaden en onverwerkte oogstvloeistoffen mycoplasma moeten bestrijden.
- De editie 2020 van Deel III van de Chinese Farmacopee "Voorbereiding en kwaliteitscontrole van dierlijke celsubstraten die worden gebruikt voor testen van biologische productproductie" vereist mycoplasmatesten voor productiecellen, waaronder Master Cell Banks (MCB), Working Cell Banks (WCB) en End-of-Production Cells (EOPC).
- De "Technische richtlijnen voor farmaceutisch onderzoek en evaluatie van immuunceltherapieproducten (proef)" bevelen aan om mycoplasma-veiligheidsgerelateerde testen uit te voeren op geschikte tussenliggende monsters op belangrijke tijdstippen of relevante maatregelen voor controle te implementeren. Mycoplasma-testen zijn ook vereist als een vrijgavetest voor eindproducten.
Nucleïnezuurtesten (NAT) en traditionele methoden:
Vóór de komst van snelle detectiemethoden zoals Nucleic Acid Amplification Technology (NAT), werden traditionele kweekmethoden en indicatorcelanalyses gebruikt. Vanwege lange detectiecycli of gevoeligheidsproblemen verlengden deze methoden echter vaak productie- of vrijgavecycli of vereisten ze voorwaardelijke vrijgave van celmaterialen op basis van risicobeoordeling of de verkenning van alternatieve methoden. Met de vooruitgang van cel- en gentherapieën is er binnen de industrie een toenemende vraag naar mycoplasmadetectiemethoden met een hogere tijdigheid en gevoeligheid. De korte houdbaarheid van producten kan geen lange testperiodes aan, dus NAT-methoden zijn naar voren gekomen als gunstige alternatieven.
Momenteel hebben de Europese Farmacopee (EP) <2.6.7>, Japanse Farmacopee (JP) en Amerikaanse Farmacopee (USP) <63> allemaal NAT-methoden opgenomen als mycoplasmadetectiemethoden. Validatie van deze methode en vergelijking met traditionele methoden om ervoor te zorgen dat de gevoeligheid ervan niet inferieur is, zijn echter vereisten voor het gebruik ervan. Hoewel de editie van 2020 van de Chinese Farmacopee (ChP) NAT niet heeft opgenomen als mycoplasmadetectiemethode, wordt de mogelijkheid genoemd om "andere methoden te gebruiken die erkend zijn door de nationale regelgevende instantie voor geneesmiddelen". In mei 2022 publiceerde het Drug Review Center van de National Medical Products Administration (NMPA) de "Technische richtlijnen voor farmaceutisch onderzoek en evaluatie van immuunceltherapieproducten (proef)", waarin wordt voorgesteld om de ontwikkeling van nieuwe steriele en mycoplasmadetectiemethoden te overwegen voor vrijgavetesten onder speciale omstandigheden wanneer het monstervolume beperkt is of snelle vrijgave nodig is en farmacopeemethoden ontoereikend zijn. Daarom wordt verwacht dat NAT-methoden steeds vaker zullen worden gebruikt door leveranciers van grondstoffen en bedrijven die geavanceerde therapeutische geneesmiddelen (ATMP's) produceren als een methode ter ondersteuning van snelle mycoplasma-vrijgavetesten.
NAT-methode - Methodevalidatievereisten
Het validatieproces voor NAT-methoden wordt uitgebreid beschreven in de Europese Farmacopee <2.6.7> en Japanse farmacopee, waarvan de inhoud in wezen consistent is. De National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC) heeft ook een artikel gepubliceerd met de titel "Considerations on Nucleic Acid Detection Methods and Methodological Validation for Mycoplasma Examination", met als doel om richtlijnen te bieden aan ontwikkelaars en gebruikers van mycoplasma nucleic acid amplification methods in China. Specificiteit, detectielimiet en robuustheid zijn essentieel voor het valideren van mycoplasma NAT-methoden. Als commerciële kits worden gebruikt voor mycoplasma-detectie, kan de geschiktheid van de methode worden gevalideerd op basis van het uitgebreide kitprestatierapport van de leverancier, gecombineerd met de laboratoriumomgeving en het type monster.
Specificiteit:
Specificiteit verwijst naar het vermogen van een analytische methode om de analyt nauwkeurig te bepalen in aanwezigheid van andere componenten (zoals onzuiverheden, afbraakproducten, hulpstoffen, enz.). De EP benadrukt de noodzaak om te focussen op kruisreacties tussen andere bacteriesoorten die nauw verwant zijn aan de fylogenetische boom, zoals Clostridium, Lactobacillus en Streptococcus binnen de Gram-positieve bacteriën. Er moet ook aandacht worden besteed aan veelvoorkomende soorten verontreinigingen zoals menselijke DNA-verontreiniging in gastheercellen en experimentele omgevingen.
Detectielimiet:
De detectielimiet is de laagste hoeveelheid analyt die in een monster kan worden gedetecteerd. Het dient als een kwalitatieve identificatiebasis en hoeft niet te worden gekwantificeerd als een exacte waarde. De EP vereist 24 detectiedatapunten voor elke mycoplasmasoort bij elke verdunningsconcentratie. Dit kan worden bereikt door drie onafhankelijke 10-voudige seriële verdunningen op verschillende dagen uit te voeren, met acht herhaalde detecties voor elke verdunningsgradiënt, of door vier onafhankelijke 10-voudige seriële verdunningen op verschillende dagen uit te voeren, met zes herhaalde detecties voor elke verdunningsgradiënt. Een detectiepositiviteitspercentage van meer dan 95% kan worden beschouwd als de detectielimiet. Voor mycoplasmatypen waarvoor bevestiging van de detectielimiet vereist is, moeten kitfabrikanten zoveel mogelijk mycoplasmatypen dekken zoals vereist door de regelgevende farmacopeeën en de detectielimieten voor elk mycoplasmatype onderzoeken. Voor biofarmaceutische bedrijven is het raadzaam om ook menselijke mycoplasmatypen te overwegen.
- Indien tijdens het productieproces vogelcellen of -materialen worden gebruikt of aangetroffen, dient een verificatie van de detectielimiet voor Mycoplasma synoviae te worden uitgevoerd.
- Indien er tijdens het productieproces insecten- of plantenmateriaal wordt gebruikt of aangetroffen, dient er een verificatie van de detectielimiet voor Acholeplasma te worden uitgevoerd.
- Porcien neusmycoplasma komt veel voor in met mycoplasma besmette monsters en heeft de aandacht getrokken van het China Institute for Food and Drug Control.
In tegenstelling tot de Europese Farmacopee wordt in de Japanse Farmacopee geen melding gemaakt van aviaire mycoplasma waarvoor verificatie van de detectielimiet vereist is, maar wel van speekselmycoplasma.
Robuustheid:
Robuustheid verwijst naar het vermogen van een methode om kleine variaties in meetomstandigheden te weerstaan zonder beïnvloed te worden, wat een basis vormt voor het gebruik van de gevestigde methode in routinematige tests. Evaluatie van robuustheid moet zich richten op de tolerantie van mycoplasmadetectiemethoden voor variaties in de concentratie van MgCl2, primers en dNTP's in detectiereagentia, veranderingen in nucleïnezuurextractiekits of extractiestappen en het gebruik van verschillende nucleïnezuurversterkers.
Vergelijkbaarheidsonderzoek
Als NAT als vervanging voor farmacopeemethoden moet worden gebruikt, is het noodzakelijk om door middel van vergelijking te bevestigen dat NAT op kweek gebaseerde methoden of indicatorcelkweekmethoden kan vervangen.Dit houdt doorgaans in dat de detectielimiet van de methode wordt overwogen, evenals de specificiteit (zoals het bereik van mycoplasma-dekking en mogelijke vals-positieve resultaten). Voor het vergelijken van detectielimieten moet het voldoen aan de criteria dat "een detectielimiet van 10 CFU/mL op kweek gebaseerde methoden kan vervangen, en een detectielimiet van 100 CFU/mL indicatorcelkweekmethoden kan vervangen."
Er zijn twee optionele benaderingen voor het uitvoeren van vergelijkbaarheidsstudies:
- Het uitvoeren van synchrone experimenten met dezelfde gevalideerde mycoplasmastammen voor zowel NAT- als farmacopeemethoden om de detectielimiet te bevestigen.
- De resultaten van de NAT-validatie moeten worden vergeleken met de resultaten van eerdere validaties van farmacopeïsche methoden. Er is echter een zorgvuldige documentatie van de bevestigingsbestanden voor de mycoplasmastandaarden die in beide methoden worden gebruikt, vereist.
NAT Mycoplasma qPCR-detectie - Uitgebreide oplossing
Gerelateerde producten
Technische diensten
- Wij leveren uitgebreide validatierapporten voor de MycAway™ Mycoplasma qPCR Test Kit.
- Het leveren van technische diensten voor het valideren van de toepasbaarheid van klantmonsters.
- Ondersteuning bieden bij audits.
| Beschrijving | Onderdeelnummer |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-detectiekit (2G) | 40619ES |