E.COLI Hostcel DNA Residu Detection Kit (2G) Validatierapport

E. coli Detectiekit voor DNA-residuen van gastheercellen (2G)

Kwalificatiesamenvatting (Cat.nr.: 4)1308(ES60)

1. Achtergrond

De in dit rapport samengevatte gegevens zijn uitgevoerd door Yeasen Biotechnologie voor 'E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G) product. De samenvattingsgegevens zijn alleen ter referentie voor de gebruiker en de gebruiker moet de hostcelresidu verifiëren DNA-methode door hun eigen monsters te gebruiken om te bevestigen dat de methode aan de vereisten van de gebruiker kan voldoen. Alle laboratoria die deze kit gebruiken, wordt aanbevolen om de volgende parameters te verifiëren: Lineariteit, Bereik, Nauwkeurigheid, Precisie, Kwantificeringslimiet, Specificiteit en Robuustheid.

Yeasen Biotechnologie kan het gedetailleerde kwalificatierapport voor deze kit leveren. Als de gebruiker dit rapport gebruikt, dan is alleen de geschiktheid (waaronder Precisie, Nauwkeurigheid en specificiteit) moeten worden geverifieerd.

2. Experimentele materialen en methoden

2.1 E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G), Leverancier: Yeasen, Cat.nr.: 41308ES60.

2.2 MolPure® Magnetische Residu DNA Monster Voorbereidingskit, Leverancier: Yeasen, Cat.nr.: 18461ES60.

2.3 Nationale norm voor E. coli DNA-gehalte: Cat. 270027, Lotnr.: 201101, concentratie: 96,2 μg/ml, opslagcondities: -70℃, gekocht bij: National Institutes for Food and Drug Control.

2.4 Originele gegevens: de elektronische versie werd vastgelegd in het 'Experimenteel rapport' het subbestand van het bovenliggende bestand 'E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)'.

2.5 Methoden: De materialen en werkwijzen die voor het experiment werden gebruikt, werden in principe door de fabrikant geproduceerd of vastgesteld. Yeasen Biotechnologie, die al lange tijd wordt beoordeeld en geverifieerd, de kitontwikkeling en -productie worden uitgevoerd volgens het ISO 13485-systeem.

3. Kwalificatie-inhoud en resultaten

3.1 Detectiebereik

Het lineaire bereik van de kit was 30 fg/μL~300 pg/μL met R²=1, en de amplificatie-efficiëntie was 101,74% met CV<15% voor elke concentratietest.

Figuur 1 E. coli DNA (2G) qPCR-standaardcurve

3.2 Nauwkeurigheid

3.2.1 Afwijking van Nationale norm voor E.coli DNA-inhoud

Het E. coli DNA-referentiemateriaal in elke batch van de kit werd gekalibreerd volgens de nationale standaard voor E. coli DNA-inhoud. Yeasen DNA-referentiemateriaal was in principe vrij van afwijkingen van de nationale norm voor E. coli DNA-inhoud kalibratiecurve en de afwijking van de assaywaarde was <5%.

3.2.2 Recoverie

3.2.2.1 Blanco monster spike recovery experiment

Monsters van E. coli DNA-standaarden in hoge en lage concentraties: 300 pg/μL, 3 pg/μL en 30 fg/μL werden respectievelijk bereid en na extractie geanalyseerd met behulp van de Magnetic Bead Method for Residual DNA Sample Pre-treatment Kit (voor elk monster werden 2 extractiereplicaten uitgevoerd en voor elke extractie werden 3 assayreplicaten uitgevoerd). De monsterwinningen en CV's werden geanalyseerd.

Voor verschillende concentraties DNA-monsters varieerden de terugvindingen van 70% tot 130% en de CV's waren allemaal <20%.

Voorbeeldtype	Theoretische concentratie	Extract 1 gemiddelde	Extract 2 gemiddelde	Gemiddelde concentratie	CV	Herstel
Blanco monster	/	/	/	/	/	/
Herstelmonster 1	300 pg/μL	250.56 pg/μL	262.11 pg/μL	256.33 pg/μL	4,41%	85,44%
Herstelmonster 2	3 pg/μL	2.29 pg/μL	2.56 pg/μL	2.42 pg/μL	7,09%	80,77%
Herstelmonster 3	30 fg/μL	33.62 fg/μL	32.61 fg/μL	33.12 fg/μL	14,28%	110,39%

Tabel 1 Herstel van blanco monster-spiking

3.2.2.2 Gesimuleerd monster-spiking-herstelexperiment

Monsters met dezelfde concentratie (3 pg/μL E. coli-DNA) werden geëxtraheerd (voor elk monster werden 2 extractie-replicaten uitgevoerd en voor elke extractie werden 3 assay-replicaten uitgevoerd) met 5 verschillende achtergrondoplossingen (hoog eiwitgehalte, hoog nucleïnezuurgehalte, hoge en lage pH, hoog zoutgehalte) en de monsterwinningen en CV's werden geanalyseerd.

Het teruggevonden DNA-monster voor verschillende achtergrondoplossingen varieerde van 70% tot 130%, waarbij alle CV's <20% waren.

Voorbeeldtype	Theoretische concentratie	Extract 1 gemiddelde	Extract 2 gemiddelde	Gemiddelde concentratie	CV	Herstel
Basismonster	/	/	/	/	/	/
Veel eiwitten	3 pg/μL	2.25	2.23	2.24	1,09%	74,74%
Hoog nucleair zuur		3.93	3.96	3,95	1,56%	131,52%
Hoog zoutgehalte		2.69	2.67	2.68	2.63	89,20%
Hoge pH		2.90	3.67	3.29	13,82%	109,55%
Lage pH		2.77	2.87	2.82	3,41%	94,01%

Tabel 2 Basismonster Spiking Recovery

3.3 Precisie

3.3.1 Herhaalbaarheid

Herhaal de test 10 keer voor E. coli DNA-standaarden bij een concentratie van 3 pg/μL met een CV <15%.

Herhalingen	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	Gemeen	CV
Detectiewaarde (fg/μL)	3.16	2.87	2.97	2.86	2.81	2.97	3.14	3.21	3.14	3.1	3.02	4,78%

Tabel 3 Herhaalbaarheidsresultaten

3.3.2 Tussenliggende precisie

Drie experimentatoren testten onafhankelijk van elkaar E. coli-DNA-standaardmonsters bij hoge en lage concentraties: 300 pg/μL, 3 pg/μL en 30 fg/μL. Voor elke concentratie werden drie replicaties uitgevoerd en de CV's van alle negen verkregen gegevens waren <15%.

Uitgave	Werkelijke concentratie Theoretische concentratie	E. coli-DNA (2G)
		300 pg/uL	3 pg/uL	30 fg/uL
Uitgave 1	Vastberadenheid 1	295,65	3.22	26.90
	Vastberadenheid 2	287.71	3.24	32.00
	Vastberadenheid 3	300.23	3.17	27.50
Uitgave 2	Vastberadenheid 4	306.06	3.13	37.30
	Vastberadenheid 5	299,76	3.02	32.70
	Vastberadenheid 6	299.63	3.02	34.00
Expeditie 3	Vastberadenheid 7	266.70	3.01	35.90
	Vastberadenheid 8	272,89	3.09	40.70
	Vastberadenheid 9	276.51	3.01	35.20
/	Gemeen	289.46	3.10	33.60
/	CV	4,89%	3,02%	13,18%

Tabel 4 Resultaten tussenliggende precisie

3.4 Specificiteit

De interferentie van cellulair genomisch DNA dat gewoonlijk wordt gebruikt bij de productie van biologische producten werd beoordeeld op interferentie met E. coli DNA-detectiereagentia. De interferentiegroep overlapt de controlegroep en er werd geen interferentie waargenomen (de onderstaande afbeelding toont, op volgorde, de interferentiegegevens van HEK293-, Vero- en CHO-genomische DNA's met E. coli DNA-detectiereagentia).

Figuur 2 Resultaten van het interferentie-experiment

3.5 Kwantificeringslimiet

E. coli DNA werd gedetecteerd bij 50 fg/μL, 40 fg/μL, 30 fg/μL, 10 fg/μL en 5 fg/μL, met 10 replicaties voor elke concentratie. De resultaten toonden aan dat de CV <20% was bij concentraties van 30 fg/μL en hoger. Dat wil zeggen dat de kwantificeringslimiet van de E. coli host cell DNA residue detection kit (2G) 30 fg/μL was.

Herhalingen Testartikel	E. coli-DNA (2G) (fg/μL)
	Hoeveelheid	Herberekeningsverhouding
1	29.43	98,09%
2	29.51	98,35%
3	32.04	106,79%
4	26.07	86,89%
5	34.06	113,53%
6	33.54	111,79%
7	26,95	89,82%
8	27.38	91,26%
9	27.04	90,13%
10	26.10	87,02%
Gemeen	29.21	/
CV	10,40%	/

Figuur 3 30fg/μL E.coli DNA (2G) qPCR-testresultaat

3.6 Robuustheid

Deze kit is getest en geschikt voor, maar niet beperkt tot, de volgende instrumenten:

Leverancier	Instrumentmodellen	Versterkingsrendementen	R2	Kwantificeringslimiet (fg/μL)	CV
Thermisch	ABI 7500	101,74%	1	30	13,30%
Thermisch	ABI QuantStudio5	100,46%	1	30	12,40%
Bio-Rad	CFX96	99,20%	0,999	30	13,76%
Shanghai Hongshi	SLAN	100,40%	0,999	30	11,67%

Tabel 5 Resultaten van de geschiktheidstest voor instrumenten

3.7 Stabiliteit

3.7.1 Vries-dooi stabiliteit

De E. coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G) werd getest door herhaaldelijk 10 keer in te vriezen en te ontdooien, en de prestaties van de kit werden niet beïnvloed.

Testindicatoren Vries-dooi tijden	Parameter	T0 tijd	10 keer invriezen en ontdooien
Standaard curveparameter	Versterkingsrendementen	98,23%	100,20%
	R2	1	0,999
Kwantificeringslimiet (30 fg/μL)	CV	15,07%	9,66%

Tabel 6 Analyse van de resultaten van de vries-dooistabiliteit

3.7.2 Versnelde stabiliteit

E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G) werden respectievelijk 30 dagen opgeslagen bij 2~8°C en 14 dagen bij 37°C. De prestaties van de kit werden niet beïnvloed.

Testindicatoren Versnelling Temperatuur & Tijd	Parameter	Experiment 1		Experiment 2
		T0 tijd	2~8℃ 30 Dagen	T0 tijd	37℃ 14 Dagen
Standaard curveparameter	Versterkingsrendementen	97,77%	99,81%	98,39%	98,65%
	R2	1	1	1	1
Kwantificeringslimiet (30 fg/μL)	CV	11,04%	13,79%	9,55%	14,55%

Tabel 7 Versnelde stabiliteitsresultaatanalyse

4. 4.Referentie

4.1 Chinese Farmacopee Commissie (ChPC). Farmacopee van de Volksrepubliek China (Vol Ⅲ) [S]. Beijing：China Medical Science and Technology Press，p.542-543, 2020.

4.2 NMPA, 2007: Algemene principes voor technische beoordeling van analytische methodevalidatie voor kwaliteitscontrole van biologische producten.

4.3 ICH(2022)《Analytische methodevalidatie Q2》, conceptversie.

Bestel Informatie