——Meer genotypering, minder tijd en minder reagentia
PCR-gebaseerde Genotypering en andere experimenten vereisen vaak de zuivering van genomisch DNA uit monsters. Wanneer er veel monsters getest moeten worden, is het proces van het zuiveren van genomisch DNA tijdrovend, repetitief en kostbaar.
Slimme PCR: Directe PCR
Figuur 1. Workflow voor directe PCR-amplificatie
A. Directe methode: Neem een kleine hoeveelheid van het monster en voeg dit direct toe aan de PCR Master Mix voor PCR-identificatie.Technische voordelen
Direct: Geen tijdrovende en dure DNA-zuivering nodig.
Snel: de templatevoorbereiding is binnen 10 minuten voltooid en de PCR-reactie is binnen 30 minuten voltooid.
Eenvoudig: Monsters kunnen worden gelyseerd zonder dat ze hoeven te worden gesneden of gemalen. Bovendien is de PCR-mix in een voorgemengde vorm, waardoor het aantal pipetteerstappen wordt beperkt.
Besparing: Er wordt weinig materiaal gebruikt.
Hoge doorvoer: lysisreacties kunnen worden uitgevoerd in een 96-wellsplaat.
Remmingsresistent: Tolerant voor verschillende dierlijke en plantaardige monsters.
Experimenteel proces met directe PCR-kit
Deze serie producten gebruikt een uniek protease-lysissysteem om monsters te lyseren. De lysisoplossing kan direct worden gebruikt als template en worden gecombineerd met de PCR Master Mix die in de kit wordt geleverd voor genamplificatie.
Figuur 2 Direct PCR-experimentproces van muizenweefsels
Afbeelding.3 Proces van direct PCR-experiment op plantenweefsel
Directe PCR-productselectietabel
| Productserie | Muis Direct PCR Tweede Generatie | |||
| Productnummer | 10189ES | 10185ES | 10188ES | 10187ES |
| Specificaties | 20 ton/50 ton/200 ton/500 ton | 50 ton/200 ton | 20 ton/50 ton/200 ton/500 ton | 50 ton/200 ton |
| Functies | ||||
| Amplicon-lengte | ≤5 kb | ≤1 kB | ≤8 kb | ≤1 kB |
| Verlengingstijd (s/kb) | 3-20 seconden | 30 seconden | ≤2 kb: 3-5 sec. ≤8 kb: 10 sec. | 60 jaren |
| Toepasselijke organismen | Muizen, ratten | Muizen, ratten | Mensen, muizen, geiten, kippen, varkens, etc. | Rijst, maïs, tabak, koolzaad, tarwe, sojabonen, enz. |
| Toepasbare weefsel-/materiaaltypen | Muizenstaart, Muizenoor, Tenen (met spieren) en andere organen | Muizenstaart, Muizenoor, Tenen (met spieren) en andere organen | Vers bloed met veelgebruikte anticoagulantia zoals EDTA, heparine, citraat, gekoeld (ingevroren) bloed en commerciële gedroogde bloedvlekken zoals Whatman903® en FTA® | Tedere bladeren, Oude bladeren, Zaailingen, Tedere stengels |
| Voorbeeldgebruik | Weefsel: 5 mg Muizenstaart: 1-5 mm | Weefsel: 5-10 mg Muizenstaart: 1-5 mm | Volbloed: 0.5%-20% Watman® gedroogde bloedvlekken: 1 mm2 | Blad: 1-10 mm Zaad: 1-3 mm |
| Genomische vrijgavetijd | 5-10 minuten | 15 minuten | 0-3 minuten | 0-10 minuten |
| Product Eindstructuur | Stompe uiteinden | Stompe uiteinden | Stompe uiteinden | Stompe uiteinden |
| Gloeitemperatuur | Tm-(2~5)℃ | Tm-(2~5)℃ | Tm-(1~2)℃ | Tm-(2~5)℃ |
| GC-knipbereik | 29-70% | 30-70% | 30-75% | 40-65% |
| 5'-3' exonuclease-activiteit | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Toepassingen | ||||
| Genotypering | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Multiplex-PCR | Tot 5x |
| Tot 3-4x |
|
| Directe monsterversterking | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Andere functies | ||||
| Elektroforese-indicator | Kleurloos | Blauw | Kleurloos | Blauw |
| Warme start | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Voorgemengd/Kit | Kit (met mix) | Kit (met mix) | Kit (met Mix+buffer) | Kit (met mix) |
Productvoordelen
De gemodificeerde Taq DNA Polymerase is de garantie voor Directe PCR: het heeft een hoge tolerantie voor remmers.
Wanneer niet-gezuiverde monsters als templates worden gebruikt, worden veel componenten geïntroduceerd die PCR-reacties remmen. Het is moeilijk om ideale resultaten te behalen, of zelfs onmogelijk om PCR-amplificatie uit te voeren, met gewone PCR-reactiesystemen en Taq DNA-polymerase. De PCR Mix in deze serie kits is een formule-geoptimaliseerde premix, die gebruikmaakt van een gemodificeerde Taq DNA-polymerase, die het bindingsvermogen aan template-DNA vergroot en een hogere tolerantie heeft voor veelvoorkomende PCR-remmers, waardoor er een bredere template-aanpassingsmogelijkheid is.
Figuur 4 De PCR-mix in de Direct PCR Kit heeft een hogere tolerantie voor onzuiverheden. Dezelfde hoeveelheid template wordt gebruikt voor PCR met verschillende PCR-mixen, en verschillende concentraties PCR-reactieremmers worden toegevoegd aan het systeem. De hoeveelheid PCR-producten onder verschillende omstandigheden wordt vergeleken.
IkGEMAKKELIJK heeft een reeks producten ontwikkeld voor verschillende monsters:
- I. Knaagdierspecifiek type: Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus (10189ES)
Toepasbare monsters: Muizenweefsel (zoals muizenstaart, muizenoor, muizenteen, enz.)
- Hoge versterkingsefficiëntie (lengte, snelheid, GC-compatibiliteit)
Fig.5 De Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus amplificeert lysaten van verschillende weefsels. 1: Plasmide; 2: Muizenoor; 3: Muizenstaart; 4: Lever. Lysiscondities: 70°C lysis gedurende 10 min, 95°C inactivatie gedurende 5 min. De doelfragmenten zijn 1 kb, 2 kb, 3 kb, en 6 kb, met extensietijden ingesteld op respectievelijk 3, 5, 10 en 20 sec/kb. M: 10510ES60 (
- Brede sjablooncompatibiliteit (10189ES)
Afbeelding 6 De Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus werd gebruikt om menselijke 293-cellen direct te lyseren (70°C gedurende 10 min) en te versterken (1), speeksel (2), en hoofdhuidweefsel (3). Alle monsters vertoonden duidelijke doelbanden, M: 10510ES60 (
- II. Multispecies Bloed Universeel Type: Bloed Geavanceerde Directe PCR Kit (10188ES)
- Versterkingslengte tot 8 kb
Figuur 7 DNA-fragmenten van verschillende lengtes werden direct uit menselijk volbloed geamplificeerd met behulp van de Blood Advanced Direct PCR Kit. De bloedmonsters werden bewaard bij -20℃ met EDTA als anticoagulans. De bloedtemplateconcentratie was 10% en de extensietijd werd ingesteld op 10 sec/kb. M: 10510ES60 (
- Hoge tolerantie
Figuur 8 A: De Blood Advanced Direct PCR Kit wordt gebruikt om een DNA-fragment van 2 kb met een GC-gehalte van 71% direct te amplificeren uit menselijk EDTA anticoagulerend volbloed. De bloedtemplateconcentratie is gradiënt-set van 0,5-50% en de extensietijd is ingesteld op 10 sec/kb. B: De Blood Advanced Direct PCR Kit wordt gebruikt om een DNA-fragment van 2,2 kb met een GC-gehalte van 67% direct te amplificeren uit muizen-EDTA anticoagulated volbloed. De bloedtemplateconcentratie is ingesteld op 0,5-50% en de extensietijd is 10 sec/kb. M: 10510ES60 (
- III. Plantspecifiek type: Plant Tissue Direct PCR Kit (10187ES)
- Geverifieerd met meerdere soorten plantenmonsters
Fig.9 Directe amplificatieresultaten van bladweefsels van verschillende soorten planten. M: 100 bp DNA-ladder. C: Gezuiverd genomisch DNA van de overeenkomstige planten als template. 1-2: Bladweefsellysaat als template. Aantal cycli: 30 cycli.
Klantcase
- I. Identificatie van het muisgenotype
Een biologisch bedrijf in Guangzhou:
Figuur 10 Amplificatie van muizenstaart met behulp van de Mouse Direct PCR Kit (10189ES). Doelgen: 500 bp; Lysistijd: 10 min; PCR-reactiesysteem: 25 μL, extensietijd: 5 sec/kb.
- II. Directe amplificatie van rijstgenen
XX Universiteit
Figuur 11 De Plant Direct PCR Kit (10187ES) wordt gebruikt om genen gerelateerd aan rijst te versterken.
Ruitgelaten Pproducten
| Productpositionering | Productnaam | Productnummer | Productspecificatie |
| Agarose van hoge kwaliteit | 10208ES60/76 | 100 gram/500 gram | |
| Nucleïnezuurkleuring (onder UV-licht) | 10202ES76 | 500 μL | |
| Snelle PCR-upgrade, kan kolonie-PCR zijn en is geschikt voor complexe template-amplificatie | 10167ES03/08 | 1 ml/5×1 ml |