A desoxirribonuclease I (DNase I) é uma endonuclease, sua aplicação não é apenas para manter a integridade do RNA, mas também para análise de pegada de DNA, geração de bibliotecas de DNA aleatórias, redução de viscosidade em lisados ​​celulares ou extratos de proteína, etc. Em uma palavra, a DNase I pode ser usada em quase qualquer aplicação que exija clivagens enzimáticas de DNA. A seguir, uma introdução detalhada à DNase I e sua aplicação específica.

1. O que é DNase I?
2. DNase I para preparação de extração de RNA livre de DNA
3. DNase I para transcrição in vitro para remover DNA molde
4. DNase I para remoção de rRNA
5. DNase I para marcação de DNA
6. Outras aplicações
7. Guia de seleção de produtos DNase I

1. O que é DNase I?

Desoxirribonuclease I (DNase I) é uma endonuclease não específica que pode digerir DNA fita simples ou dupla, que está presente em diferentes tecidos e fluidos corporais. Pode hidrolisar ligações fosfodiéster para produzir mono e oligodesoxinucleotídeos contendo um grupo 5'-fosfato e um grupo 3'-OH. A faixa de pH de trabalho ideal da DNase I é 7-8, sua atividade depende de Ca2+ e pode ser ativada por íons metálicos divalentes, como Mn2+, Mg2+, Zn2+, etc. Na presença de Mg2+, a DNase I corta aleatoriamente qualquer sítio de DNA fita dupla; na presença de Mn2+, a DNase I pode cortar DNA fita dupla no mesmo sítio para formar uma extremidade romba ou uma extremidade pegajosa de 1-2 nucleotídeos.

Figura 1. Diagrama esquemático da clivagem do dsDNA pela DNase I na presença de Mg2+ e Mn2+.

Embora as clivagens da DNase I sejam geralmente consideradas clivagens não específicas, a DNase I tem mais probabilidade de atuar em certos fragmentos de sequência, como a região do sulco menor, e é mais propensa a clivagens de sequências de purina-pirimidina. No entanto, quando a DNase I atua em dsDNA heterogêneo, todas as quatro bases serão clivadas, e o efeito em uma base específica não será mais do que 3 vezes maior do que o de outras bases.

2. DNase I para preparação de extração de RNA livre de DNA

Em experimentos biológicos, o primeiro passo é preparar o ácido nucleico para estudar várias funções do RNA. No entanto, como o DNA e o RNA são frequentemente liberados juntos durante o processo de lise celular, a interferência nos dois não pode ser evitada, não importa qual solução de extração seja usada, então enzimas específicas precisam ser usadas para remover a interferência. Para extração de RNA de alta qualidade, a DNase I é usada para remover o DNA residual da amostra.

A DNase I pode degradar DNA fita dupla e fita simples em oligonucleotídeos e nucleotídeos simples, e o DNA no produto de preparação de RNA pode ser efetivamente degradado. A DNase I é então inativada por aquecimento com um tampão de parada. Durante o processo de aquecimento, a estrutura em grampo da molécula de RNA pode ser aberta, o que facilita a entrada direta do RNA no processo de transcrição reversa.
A qualidade do RNA afetará diretamente os dados experimentais em grande extensão. Em geral, resíduos de gDNA não podem ser completamente evitados durante a extração de RNA, portanto, é geralmente recomendado tratar amostras de RNA com DNase I para digerir o gDNA residual antes de desafiar aplicações downstream (por exemplo, análise de expressão de mRNA, análise de transcriptoma, etc.). A etapa de digestão do gDNA pode ser realizada durante a extração de RNA, após a extração de RNA ou antes da transcrição reversa do RNA.De acordo com o posicionamento do produto, os produtos fornecidos pela Yeasen são os seguintes:

Tabela 1: Lista de produtos relacionados à remoção de DNA da extração de RNA ou antes da transcrição reversa

3. DNase I para transcrição in vitro para remover DNA molde

A transcrição in vitro (IVT) usa principalmente DNA como molde, mais substratos e tampões correspondentes para obter RNA por meio da transcrição in vitro. Em experimentos de transcrição in vitro, RNA polimerases como T7, T3 e SP6 são comumente usadas para síntese de RNA. O RNA sintetizado pode ter resíduos de DNA. Eliminar os resíduos de DNA é benéfico para o desenvolvimento de experimentos posteriores. Por exemplo, no estágio de desenvolvimento da vacina de mRNA, a remoção de resíduos é uma etapa crítica, que pode reduzir a dificuldade de purificação posterior e aumentar a pureza do produto. O molde de DNA é tipicamente removido usando DNase I recombinante (sem RNase).De acordo com o processo de síntese de mRNA, os produtos fornecidos pela Yeasen são os seguintes: