À medida que as pessoas prestam cada vez mais atenção às preocupações relacionadas à saúde, o campo de diagnóstico in vitro (IVD) está se desenvolvendo rapidamente. Em particular, o surgimento da COVID-19 acelerou a expansão do mercado de IVD. Atualmente, o RT-qPCR tem sido amplamente utilizado no desenvolvimento de produtos reagentes de diagnóstico de IVD, mas os reagentes de diagnóstico líquido RT-qPCR têm altos custos de transporte, desempenho instável e vida útil curta. Os reagentes de secagem podem contornar perfeitamente as deficiências dos reagentes de diagnóstico líquido RT-qPCR. Então, como os reagentes de secagem devem ser feitos? Como escolher o método de produção?

1. O que são reagentes de secagem?

2. O que é secagem ao ar?

3. O que é liofilização?

4. Qual é a diferença entre liofilização e secagem ao ar?

5. Produtos relacionados e desempenho

1. O que são reagentes de secagem?

Os reagentes de secagem são os reagentes obtidos após a amostra ser seca e desidratada. Os reagentes de secagem podem ser entregues em temperatura ambiente e não requerem transporte em cadeia fria. Pode evitar o congelamento e descongelamento repetitivos de reagentes para afetar o desempenho e a vida útil dos reagentes e reduzir muito o custo do transporte. Não é apenas fácil para as pessoas usarem, mas também diminui as demandas dos operadores. A indústria de diagnóstico molecular está interessada em secar reagentes principalmente porque eles podem ser transportados e armazenados em temperatura ambiente. Existem agora duas técnicas de secagem amplamente utilizadas: liofilização e secagem ao ar. A tecnologia de secagem ao ar é mais barata, enquanto a tecnologia de liofilização é a mais popular, ambas com suas vantagens. Existem dois métodos de produção de reagentes de secagem: secagem ao ar e liofilização. O que são e como escolher?

2. O que é secagem ao ar?

A secagem ao ar é uma técnica de secagem que pode ser usada para preparar reagentes de secagem. A secagem ao ar é dividida em três processos: secagem ao ar natural, secagem ao ar quente e secagem ao ar natural de imitação. No processo de produção industrial, para garantir a estabilidade da qualidade e da saída do produto, o reagente é frequentemente seco com secagem ao ar quente. Para reagentes de diagnóstico IVD, um forno de precisão com uma função de soprador ou vácuo é geralmente usado para secar o líquido a uma temperatura maior que a temperatura ambiente (secagem a 50 °C por 80 minutos). O líquido é seco ao ar em um material seco viscoso. O processo específico é mostrado na Figura 1.

Fig 1. Secagem com ar quente

A chave para secar reagentes moleculares líquidos não é apenas garantir que a enzima possa ser rapidamente hidratada após a secagem, mas também garantir que a estabilidade, sensibilidade e especificidade dos reagentes secos não sejam afetadas. A secagem ao ar requer apenas um forno de precisão. Comparado com a liofilização, o equipamento é mais barato e o consumo de energia é menor, então o custo dos reagentes é menor. Além disso, o processo de secagem ao ar é simples e o tempo de secagem é menor (dentro de 2 horas). A secagem ao ar tem vantagens e desvantagens. Durante o processo de secagem ao ar, vários componentes, incluindo enzimas, serão perdidos com a evaporação da água. Não apenas isso, mas a solução de reação e seus componentes também serão prejudicados pela alta temperatura de 50 °C. Alguns componentes também são mais facilmente oxidados, então a vida útil dos reagentes secos ao ar será menor. Além disso, o reagente de secagem ao ar tem forte viscosidade e é fácil de pendurar na parede, e tem baixa capacidade de reidratação.A liofilização pode compensar as deficiências da secagem ao ar.

3. O que é liofilização?

Diferente da secagem ao ar, a liofilização é uma tecnologia especial de secagem, cujo princípio básico é baseado na mudança trifásica da água. As três fases da água são sólida, líquida e gasosa, e as três fases podem coexistir e se transformar. Quando a pressão é maior que 610,75 Pa, com o aumento da temperatura, o gelo derrete em água, e a água evapora e se transforma em vapor. Quando a pressão é menor que 610,75 Pa, o gelo é diretamente sublimado em vapor de água por aquecimento. Especificamente conforme mostrado na Figura 2. A liofilização usa o princípio da transição de fase da água. Primeiro, os reagentes líquidos são congelados a -30℃~-40℃, de modo que a maior parte da umidade do material é congelada em gelo. O gelo é sublimado em vapor de água em um vácuo mais alto, fornecendo uma fonte de calor de baixa temperatura. O vapor de água é condensado por um condensador no sistema de vácuo para que outro material permaneça no gelo, obtendo assim produtos secos.

Fig 2. Diagrama de fases para água

Então, quais são as principais formas de reagentes liofilizados? Os reagentes liofilizados IVD são divididos principalmente em três formas: Liofilização de Frasco de Penicilina, Liofilização in situ e Microesfera Liofilizada. As três formulações liofilizadas são mostradas na Figura 3. Diferentes formas têm suas vantagens e desvantagens. A Liofilização de Frasco de Penicilina é a forma mais industrializada. Não só tem linhas de produção totalmente automáticas, mas também tem um processo completo de verificação e controle de risco. O processo é o mais simples e maduro. A desvantagem é que o custo de um frasco de Penicilina é alto, e a quantidade de enchimento não deve ser muito pequena. No entanto, a quantidade de cada reagente IVD é muito pequena, então ele precisa ser preenchido para várias porções ou usado várias vezes ao mesmo tempo. Se não for usado, ele precisa ser armazenado separadamente, e a conveniência está faltando.

Liofilização in situ significa que todos os componentes do reagente são diretamente liofilizados no kit, o que é mais conveniente de usar. No entanto, a distribuição de frio e calor no liofilizador é tendenciosa, e a colocação dos kits também é diferente, então a consistência dos lotes é difícil de controlar. Além disso, a taxa de utilização de liofilizadores in situ é muito baixa, então o custo de amortização é alto. Se uma grande quantidade de liofilização in situ for realizada, os pós liofilizados serão contaminados de forma cruzada.

Fig 3. Forma dos reagentes liofilizados

A microesfera liofilizada pode atingir quantificação precisa, pessoa única e porção única, o produto é mais conveniente de usar. Também pode ser tratado por um processo especial para evitar absorção de umidade, atingir armazenamento em temperatura ambiente e resolver vários pontos problemáticos ao mesmo tempo. A desvantagem é que o desenvolvimento da tecnologia de microesfera liofilizada é difícil e a exigência de controle de processo é alta. Os reagentes liofilizados precisam escolher a melhor forma de acordo com as cenas de aplicação. A microesfera liofilizada tem vantagens únicas e é adequada para uma variedade de cenas de aplicação, que são mais promissoras no mercado.

4. Qual é a diferença entre liofilização e secagem ao ar?

O processo único de liofilização determina suas vantagens únicas. Comparada com a secagem ao ar, a liofilização é superior à secagem ao ar em muitos aspectos. As vantagens da liofilização são as seguintes:

A liofilização é realizada em baixa temperatura, para que a enzima não seja desnaturada ou perca atividade biológica, e a atividade biológica seja completa.Como a secagem é realizada em um estado congelado, o volume de reagentes de secagem é quase inalterado, e a estrutura original é mantida sem encolhimento. Ao secar em baixa temperatura, a perda de alguns componentes voláteis nos reagentes de secagem é muito pequena, o que é adequado para a secagem de reagentes. Sais inorgânicos não serão precipitados na superfície do material durante a secagem, evitando o endurecimento da superfície do material. O material seco é solto e poroso, dissolvido rápida e completamente após a adição de água, e restaurado ao seu caráter original quase imediatamente. Como a secagem é realizada sob vácuo com muito pouco oxigênio, algumas substâncias facilmente oxidáveis ​​são protegidas. A secagem pode remover mais de 95% a 99% da umidade para que os produtos secos possam ser armazenados por um longo tempo sem deterioração.

As principais diferenças entre liofilização e secagem ao ar são as seguintes:

Tabela 1. As diferenças entre liofilização e secagem ao ar

Embora os reagentes liofilizados custem mais e levem mais tempo, os reagentes produzidos pela liofilização são mais estáveis ​​e fáceis de usar, o que está exatamente em linha com a direção do desenvolvimento de reagentes de diagnóstico. Portanto, desde o advento desta tecnologia, ela se tornou cada vez mais popular. Ela tem sido amplamente usada em vários campos, como detecção de doenças, detecção de vírus e patógenos, detecção de segurança alimentar, detecção de animais e detecção ambiental.

5. Produtos relacionados e desempenho

As matérias-primas nos reagentes de diagnóstico de DIV são a chave.Materiais não liofilizados não podem ser removidos diretamente de materiais liofilizados, e cada componente precisa ser rastreado e depurado. Portanto, a Yeasen Biotechnology está aumentando continuamente o investimento neste aspecto e se esforça para fornecer aos clientes matérias-primas liofilizadas estáveis ​​e de alta qualidade, que vão rapidamente ao mercado.

Os produtos relacionados que a Yeasen pode fornecer são mostrados na Tabela 2:

Tabela 2. Lista de produtos

O kit Hieff Unicon® V Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR (com MgCl2) (Cat#13775) é um reagente de diagnóstico líquido sem glicerol, compatível com liofilização (lyo-ready). Este produto é uma escolha ideal para o desenvolvimento de multiplex RT-qPCR que tem estabilidade em temperatura ambiente e pode ser enviado e armazenado em temperatura ambiente.

Desempenho: O modelo do pseudovírus foi amplificado por RT-qPCR múltiplo usando reagentes líquidos (vermelho) e 13775 reagentes liofilizados (roxo), respectivamente. O gráfico da esquerda é o canal FAM, o da direita é o canal VIC. Os resultados mostraram que a atividade dos reagentes 13775 estava intacta após a liofilização, e ainda tinha capacidade de reação múltipla de alta eficiência. Especificamente como mostrado na Figura 4.

Fig 4. Desempenho do produto 13775 após liofilização

Os 13775 reagentes liofilizados foram colocados a 37°C (verde) e -20°C (azul) por 21 dias para múltiplos testes de amplificação RT-qPCR. O gráfico da esquerda é o canal FAM, o da direita é o canal VIC. Os resultados mostraram que o reagente liofilizado ainda teve um bom efeito de amplificação após ser colocado a 37°C por 21 dias. Especificamente como mostrado na Figura 5.

Fig 5. Estabilidade térmica do reagente liofilizado 13775 — 37 °C por 21 dias.

6.Guia de seleção de produtos

Processo	Descrição	Nome do produto	SKU
Processamento de amostra	Digestão de proteínas	Proteinase K	10401ES
	Extração de RNA	DNase I recombinante (sem RNase)	10325ES
	Inibição de RNase	Inibidor de RNase murina (40 U/μL)	10603ES
Transcrição reversa	Adequado para RT-qPCR	Transcriptase reversa Hifair V (200U/ μL)	11300ES
		Hifair V Reverse Transcriptase (600U/ μL) GlyceroL- livre	11301ES
Amplificação por PCR	DNA polimerase de partida a quente	Hieff UNICON Hotstart E-Taq DNA Polimerase	10726ES

Sobre a leitura:

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