Com o rápido desenvolvimento da biotecnologia, a terapia de mRNA, como um método de tratamento emergente, atraiu muita atenção devido à sua forte programabilidade e rápida velocidade de resposta. Nos campos de vacinas de mRNA e terapia genética, sintetizar eficientemente mRNA de alta qualidade é um passo fundamental para atingir objetivos terapêuticos. Durante esse processo, a T7 RNA polimerase (T7 RNAP) desempenha um papel essencial, ela pode catalisar eficientemente a síntese in vitro de mRNA.
Embora o T7 RNAP desempenhe um papel crucial na síntese de mRNA, ele frequentemente produz RNA fita dupla (dsRNA) como um subproduto na prática. O dsRNA é uma das marcas registradas de muitos vírus e, portanto, é facilmente reconhecido por proteínas de ligação ao dsRNA intracelular, desencadeando respostas imunes inatas e reações inflamatórias. Isso significa que se as formulações de mRNA contiverem um nível mais alto de dsRNA, isso pode levar à ativação imune desnecessária, o que pode afetar a eficácia terapêutica ou causar efeitos colaterais sérios. O dsRNA excessivo também pode interferir na função normal do mRNA, incluindo a eficiência da tradução e a estabilidade do mRNA, afetando indiretamente a eficácia da terapia com mRNA.
Figura 1: O impacto dos subprodutos de dsRNA e a reação otimizada de RNAP T7.
Portanto, desenvolver e adotar métodos eficazes para reduzir a geração de dsRNA é uma parte crucial do desenvolvimento da tecnologia de mRNA. Pesquisadores desenvolveram várias estratégias, incluindo o uso de polimerases de RNA T7 aprimoradas, nucleotídeos de modificação, otimização de tampões de transcrição IVT e processos de purificação downstream. A
Dados do produto
Rendimento: mais de 9 mg/mL
Conteúdo de dsRNA: o conteúdo de dsRNA foi significativamente reduzido em pelo menos 10 vezes
Eficiência de limitação: mais de 99%
Baixo dsRNA T7 RNA polimerase Processo de triagem:
1) a construção de uma biblioteca aleatória e método de triagem de alto rendimento FADS, uma biblioteca de mutações aleatórias de mais de 10^6 foi rastreado.
2) design semirracional e tecnologia de microplaca foram usados para rastrear uma biblioteca saturada de sítio. Ambos os métodos produziram mutantes de RNA polimerase T7 de dsRNA baixo. Considerando o conteúdo de dsRNA enquanto se garante que outros indicadores não sejam reduzidos (como integridade/eficiência de cobertura/rendimento, etc.), vários mutantes foram selecionados e um chamado CleaScrip™ T7 foi usado para aplicação comercial.
Dados do produto
Em diferentes cenários de aplicação de comprimento, a RNA polimerase T7 de dsRNA baixo mostrou uma diminuição altamente significativa em comparação ao WT T7 e aos produtos concorrentes, garantindo ao mesmo tempo que o rendimento e a integridade não sejam reduzidos.
| Comprimento do fragmento | Polímero de RNA T7 | Colheita(mg/ml） |
Integridade(%） | Conteúdo de dsRNA (ng de dsRNA produzido por 1ug de RNA) |
| 4K | T7-WT | 12.4 | 88,3 | 0,4273 |
| CleaScript™ T7 | 12.1 | 89,9 | 0,0129 | |
| Empresa A | 11.0 | 87,8 | 0,0323 | |
| 9K | T7-WT | 9,5 | 81,9 | 2.9180 |
| CleaScript™ T7 | 9.0 | 82,0 | 0,0379 | |
| Empresa A | 7.2 | 78,7 | 0,1805 |
Usando uma concentração de cap de 2,5 mM, excelente eficiência de capping ainda pode ser alcançada em diferentes comprimentos de fragmentos em comparação com WT. Além disso, desempenho superior de expressão de proteína também é observado no nível celular.
| Entrada analógica de tampa（mM） | Limitando a eficiência（%）4K | |
| Peso | Baixo dsRNA | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2,5 | 100 | 100 |
A patente foi registrada nos Estados Unidos.
Informações do produto
| Nome do produto | Número de catálogo | Especificação | Volume |
| CleascripTM T7 RNA Polimerase (baixo dsRNA, 250 U/μL) | 10628ES | 100 /2500 /25.000 KU | 400 μL/10 mL/100 mL |
| CleascripTM T7 RNA polimerase grau GMP (baixo dsRNA, 250 U/μL) | 10629ES | 100 /2500 /25.000 KU | 400 μL/10 mL/100 mL |