Figura 1: Processo de transcrição de RNA in vitro

Vantagens do produto

Alto rendimento: pode produzir até 200 μg em 2 horas por meio de reação de transcrição

Maior versatilidade: adequado para transcrição de RNA 20nt-10000nt

Excelente desempenho: reduzir efetivamente os subprodutos da transcrição durante o processo IVT

Aplicações múltiplas: pode ser usado para síntese de RNA comum, marcado e modificado

Propriedades do produto

Figura 2: Rendimento de transcrições de diferentes comprimentos

Figura 3: Qualidade de transcrições de diferentes comprimentos

Figura 4: Expressão de transcrito mRNA em HEK-293 células

Nota: O mRNA foi encapsulado com enzima de encapsulamento de vacínia (Yeasen#10614/10615).

Métodos experimentais

Reagentes de descongelamento

Centrifugue brevemente a mistura de RNA polimerase T7 e coloque isto no gelo. Descongele o tampão de transcrição 10× e o ribonucleotídeoe (ATP, CTP, GTP, UTP), misture e centrifugue até o fundo do tubo, coloque 10×Tampão de Transcrição em temperatura ambiente e coloque 4 tipos de ribonucleotídeos no gelo.

B.Reação de transcrição de montagem à temperatura ambiente

Prepare o sistema de reação de acordo com o seguinte sistema:

Componentes	Volume (µL)	Concentração final
RNase livre H2O	Até 20	-
10×Buffer de transcrição	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM cada)	2 cada	10 mM cada
Modelo de DNA	1 µg	-
Mistura de RNA polimerase T7	2	-

Notas:

1. A reação é configurada em temperatura ambiente. Como o 10× Transcription Buffer contém espermidina, a alta concentração de espermidina pode causar precipitação do molde de DNA em baixa temperatura.
   Para transcrições curtas (<100 nt), pode ser usado um modelo de 2 µg, com tempo de transcrição estendido para 4-8 horas.
   3. Para transcrições longas (>1000 nt), é recomendado usar plasmídeos linearizados como modelos para transcrição.
   4. Realize a reação no instrumento de PCR com a tampa quente aberta para evitar a evaporação.
   5. O produto da reação pode ter um precipitado branco. O precipitado é o pirofosfato de magnésio produzido por os íons pirofosfato e magnésio livres na solução de reação que não afetam os experimentos subsequentes. Se você quiser removê-los, pode adicionar um pouco de EDTA. Se a adição de EDTA afetar os experimentos subsequentes, o sobrenadante também pode ser recuperado por centrifugação.
   6. Mantenha os reagentes e recipientes sem contaminação por RNase.

C.Incubar a 37°C por 2 horas

Misture a solução dos componentes, centrifugue brevemente até o fundo do tubo e incube a 37°C por 2 hs. Se o comprimento do transcrito for menor que 100 nt, estenda o tempo de reação para 4-8 hs.

Tratamento com D.DNase I (opcional)

Após a conclusão da reação, adicione 2 μL de DNase I (sem RNase) a cada tubo e incubar a 37 °C por 15 minutos para remover o DNA molde.

Perguntas frequentes

1. Baixo rendimento de transcrição

A qualidade do template está intimamente relacionada ao rendimento. O rendimento do grupo experimental é significativamente menor do que o do grupo de controle. As possíveis razões são:

• O modelo experimental contém componentes inibitórios;
• Talvez o modelo tenha algo errado.

Sugestões: ① Repurificar o modelo; ② Determinar a quantificação do modelo e sua integridade; ③ Estender o tempo de reação; ④ Aumentar a quantidade de entrada do modelo; ⑤ Usar outros promotores e outras RNA polimerases.

2. Baixo rendimento de transcrições curtas

Fragmentos curtos de template podem inibir a reação. Quando o produto de transcrição for menor que 100 nt, se você quiser aumentar o rendimento, estenda o tempo de reação para 4-8 hs ou aumente a quantidade de template para 2 μg.

3. O comprimento da transcrição do RNA é maior do que o esperado

Se o resultado da eletroforese mostrar que a banda do produto é maior do que o tamanho esperado, os possíveis motivos podem ser: ①O molde do plasmídeo pode não estar completamente linearizado; ②A extremidade 3' da fita sentido tem uma estrutura proeminente; ③O RNA tem uma estrutura secundária que não é completamente desnaturada.

Sugestões: ①Verifique se o modelo está completamente linearizado e, se necessário, realize linearização adicional; ②Selecione uma enzima de restrição adequada para evitar saliências 3' ou use o Fragmento de Klenow/DNA polimerase T4 para completar a transcrição antes de prosseguir; ③Use gel desnaturado para detectar produtos de RNA.

4. O comprimento da transcrição do RNA é menor do que o esperado

Se a eletroforese mostrar que a banda do produto é menor que o tamanho esperado, as possíveis razões são: ①O modelo contém uma sequência de terminação semelhante ao terminador da RNA polimerase T7; ②O conteúdo GC de o modelo é muito alto.

Sugestões: ①Reduza a temperatura da reação (por exemplo, 30°C). Às vezes, reduzir a temperatura pode contribuir para estender o comprimento da transcrição, mas pode reduza o rendimento. Tente outro RNA polimerases para transcrição; ②Se o conteúdo de GC do modelo for alto, realize a reação a 42℃ ou adicione SSB para aumentar o rendimento e o comprimento da transcrição.

5. Cauda eletroforética de produtos transcricionais

A formação de cauda durante a eletroforese pode ser causada por: ① Contaminação por RNase durante a operação experimental; ②O molde de DNA está contaminado com RNases.

Sugestões: ①Use pontas de pipeta e tubos EP livres de RNase, use luvas e máscaras de látex descartáveis ​​e todos os reagentes sejam preparados com H livre de RNase₂O. ②Repurifique o DNA modelo.

Informações para pedidos

Nome do produto	Número de catálogo	Sespecificação
Kit de síntese de RNA de alto rendimento T7	10623ES	50/100/500 toneladas
T7 RNA polimerase grau GMP (250 U/μL)	10625ES	10 KU/100 KU/2500 KU/25 MU
Pirofosfatase, grau GMP inorgânico (1 U/μL)	10620ES	10U/100U/1000U
Inibidor de RNase murina grau GMP (40 U/μL)	10621ES	10 KU/20 KU/100 KU/1 MU
Enzima de encapsulamento de vacínia mRNA grau GMP	10614ES	2 KU/10 KU/100 KU
mRNA Cap 2'-O-Metiltransferase grau GMP	10612ES	10 KU/50 KU/250 KU
Desoxirribonuclease I (DNase I) grau GMP	10611ES	500/2000/10000 U
Kit mestre de isolamento de mRNA Hieff NGS®	12603ES	24/96 T