Este artigo descreve a aplicação da Concanavalina A e seu acoplamento covalente com esferas magnéticas.
Parte 1. Concanavalina A
As esferas magnéticas revestidas com Concanavalina A (esferas ConA), como o nome sugere, são esferas biomagnéticas nas quais a lectina vegetal Concanavalina A (ConA) é acoplada a nanomateriais superparamagnéticos. A seguir, uma breve introdução às esferas magnéticas ConA.
Concanavalina A (ConA), uma proteína lectina vegetal sem especificidade de grupo sanguíneo, foi a primeira proteína lectina vegetal a ser isolada, purificada e cristalizada da siba (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) desde 1936.
ConA tem 2 formas principais dependendo do pH da solução em que está presente: o homodímero α-2 ou o homotetrâmero α-4 [2]. Sob condições alcalinas (pH>7,0) ele existe como um tetrâmero (consistindo de quatro subunidades de peso molecular de 26 kDa); sob condições ácidas (pH 4,5-5,5) Con A dissocia-se em uma estrutura dimérica ativada (52 kDa). Além disso, a função de ConA é afetada por cátions divalentes, por exemplo, na ausência de íons metálicos (Ca2+ e Mn2+), sua conformação e função de ligação à glicoproteína não podem ser realizadas[1].
Fig. (1). Modelagem molecular de (A) monômero ConA, (B) dímero ConA, (C) tetrâmero ConA com manose, glicose e íons metálicos.
Parte 2. Contas
As esferas biomagnéticas são uma classe de microesferas magnéticas com tamanho de partícula nanométrico, formadas por polímeros e nanopartículas magnéticas inorgânicas. As esferas magnéticas podem ser classificadas em três categorias principais de acordo com sua estrutura: estrutura do tipo núcleo-casca, estrutura do tipo sanduíche e estrutura do tipo difuso. Os materiais magnéticos incluem pó de ferro puro, ferro carbonílico, minério magnético, ortoferrita e liga de ferro-cobalto, e outros.
Nanomateriais magnéticos, devido aos seus efeitos especiais, como efeito de tamanho pequeno, efeito de superfície e efeito de tamanho quântico, etc., no tamanho de Fe3O4 nanopartículas é menor que 30 nm, a interferência da perturbação térmica dentro das nanopartículas é significativa, e neste momento, essas nanopartículas mostram uma propriedade magnética especial, ou seja, superparamagnetismo. Fe superparamagnético3O4 As nanopartículas são amplamente utilizadas na indústria biológica devido às suas propriedades de alta qualidade, como não toxicidade, boa biocompatibilidade, propriedades únicas de direcionamento magnético e facilidade de geração de calor em campos magnéticos alternados.
Em contraste, o acoplamento covalente de ConA com microesferas para imobilização de biomoléculas tem as seguintes vantagens:
- Alta estabilidade de ligação de acoplamento covalente para reprodutibilidade;
- Ligação do ligante ConA na superfície de microesferas para interações com moléculas alvo;
- Caracterização cinética do ambiente da solução, adequado para manipulação experimental biológica;
Parte 3. Aplicação de esferas magnéticas ConA
Conforme relatado na literatura, as principais aplicações das esferas magnéticas ConA são categorizadas em 3 cenários: realização de separação da membrana citoplasmática, enriquecimento de glicoproteínas e separação de aspectos celulares imobilizados.
Aplicação I: Separação da membrana citoplasmática
Usando esferas magnéticas ConA afetadas pela ativação de cátions divalentes, de modo que existe em Ca2+ e Mg2+ ambientes de solução, que possuem a função de interação de afinidade de α-D-manosil terminal e α-D-glicosil, usados na purificação da membrana plasmática, são uma maneira simples e eficiente. Por exemplo, a separação da membrana plasmática de células ou tecidos é uma etapa fundamental para obter proteínas da membrana plasmática. ConA é capaz de ligar proteínas glicosiladas em células, e esse princípio pode ser utilizado para obter membrana plasmática de maior pureza. As principais etapas da operação são: imobilização de ConA em esferas magnéticas pela ligação de ConA biotinilado a esferas magnéticas de estreptavidina; incubação de membranas celulares com esferas magnéticas de ConA por 1h; adsorção em um suporte magnético; lavagem com TBS por 5 vezes; e eluição da solução de membrana citoplasmática com eluente[3].
Fig 2. Etapas de purificação de esferas magnéticas ConA para membrana plasmática
Aplicação II: Enriquecimento de glicoproteínas
ConA é específico para manose e glicose e reconhece manose conjugada α, que por acaso é o “oligossacarídeo central” de muitas glicoproteínas de soro e membrana celular. Portanto, pode ser usado em imunologia para separar moléculas glicosiladas, como glicoproteínas em lisados de células ou tecidos ou soro.
Um procedimento importante foi que por ligação cruzada de nanopérolas magnéticas aminosilanizadas (MNPs) com ConA por meio de um ligante bifuncional, linoleato de bis-N-hidroxissuccinimida (DSS), para obter esferas magnéticas de ConA; para terminar a ligação não específica das nanopérolas magnéticas usando metoxietilenoglicol (MEG) e para realizar a separação magnética; para adicionar o extrato das proteínas da membrana celular digeridas com tripsina para incubar as esferas magnéticas de ConA e os glicopeptídeos capturados e, finalmente, para eluir os glicopeptídeos capturados e para realizar a secagem a vácuo. As esferas magnéticas de ConA foram incubadas, as esferas magnéticas de ConA que tinham glicoproteínas ligadas foram coletadas pelo suporte magnético, os não glicopeptídeos foram lavados e, finalmente, os glicopeptídeos capturados foram eluídos e secos a vácuo. Este método permite uma análise aprofundada de locais de glicosilação específicos de proteínas associadas a tumores (por exemplo, EGFR)[4].
Fig 3. Nanopartículas superparamagnéticas acopladas a diferentes lectinas
Aplicação III: Isolamento de células imobilizadas
O uso de esferas magnéticas ConA (esferas magnéticas ligadas covalentemente à Concanavalina A companheira de alta pureza) para se ligar a glicoproteínas em membranas celulares ou membranas nucleares, capturando assim células ou núcleos, permite a visualização da manipulação experimental de pequenos números de células. Por exemplo, esferas magnéticas ConA são usadas em CUT&Tag e CUT&RUN [5] experimentos, que são novas técnicas usadas para estudar a estrutura e a função da cromatina, e são imobilizados pela ligação de esferas magnéticas ConA às células para visualizar a operação e evitar o problema de perda de células causada pela centrifugação.
Em comparação com a tecnologia tradicional ChIP-seq para estudar interações DNA-proteína, CUT&Tag e CUT&RUN têm as seguintes vantagens:
- As esferas magnéticas ConA se ligam às glicoproteínas da membrana celular para visualizar a operação e melhorar a experiência da operação experimental;
- Não há necessidade de centrifugação, apenas esferas magnéticas ConA adsorvidas no suporte magnético para completar a separação de amostras de células e soluções;
- Pode ser operado com apenas 10 células, evitando a necessidade de um grande número de amostras para ChIP-seq.
Fig 4. Diagrama esquemático do fluxo do experimento ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN
Parte 4. Contas magnéticas revestidas com YEASEN Concanavalina A
As esferas magnéticas ConA, desenvolvidas pela YEASEN, são capazes de se ligar a glicoproteínas, glicolipídios, polissacarídeos e outras moléculas com modificação de glicosilação de forma rápida, eficiente, sensível e específica após seleção rigorosa de matéria-prima e otimização e melhoria de múltiplos processos. Elas são usadas principalmente para isolamento de células ou para o isolamento de moléculas glicosiladas, como glicoproteínas em lisados de células ou tecidos ou soro, e são especialmente usadas diretamente para experimentos como CUT & RUN e CUT & Tag (uma tecnologia inovadora para experimentos ChIP-seq).
1.Características do produto
- Produção de lote estável e melhor reprodutibilidade dos resultados;
- Armazenamento de desempenho estável
- Eficiência de captura de células>90%
2.Informações do produto
| Gato Nº. | Gato#19810ES |
| Tamanho | 1 mL/5 mL/20 mL |
| Cor | Amarelo acastanhado |
| Concentração de esferas | 10 mg/mL |
| Conteúdo sólido | 9-11 mg/mL |
| Tamanho da conta | 1 µm |
| Capacidade | 105 células/esferas de µL |
3. Dados de desempenho do produto
(1)Monodispersidade
Sob as mesmas condições de tratamento e sob a ampliação de 10×/40×, as esferas ConA foram basicamente monodispersas, e nenhuma aglomeração óbvia foi observada em relação ao concorrente.
| Contas de matéria-prima YEASEN | Contas ConA do concorrente | Contas YEASEN ConA (Cat. nº 19810) |
Figura 5. Gráfico de resultados de monodispersão
(2)Efeito da ligação de células de esferas ConA
O mesmo número de células foi incubado com as esferas pelo mesmo período de tempo, e o número de células restantes após a conjugação das esferas ConA foi detectado automaticamente no analisador de células, e os resultados mostraram que o YEASEN As esferas ConA (Cat#19810) superaram os produtos dos concorrentes.
| Suspensão celular | Células restantes após a ligação de esferas magnéticas competitivas de ConA | Células restantes após a ligação de YEASEN Contas magnéticas ConA |
Figura 6.Imagem de células ligadas por esferas magnéticas ConA
(3)Número de ligação celular e repetibilidade
Tanto o YEASEN de 10µL ConA Beads (Cat#19810) e os 10µL Competitor ConA Beads, ligam números de células de nível E7 comparáveis ao concorrente. A captura de células foi >90% sob operações repetidas.
Figura 7. Os resultados de contas ConA ligando número de células e taxa de captura
(4) Estabilidade de aceleração
Dispensar a 1 mL/tubo. As condições de armazenamento foram: tratamento acelerado de 4℃, 37℃ por 2, 4, 7, 11 e 14 dias, e tratamento de destruição de -20℃ por 1, 3, 6 e 8 dias. Os resultados mostraram que sob as mesmas condições experimentais: a taxa de captura de células dos produtos armazenados a 4℃, tratamento acelerado a 37℃ e tratamento de destruição a -20℃ foi >95%, e o valor CV dos três grupos de réplicas sob cada condição de tratamento estava dentro de 1%, o que mostrou boa reprodutibilidade.
Fig 8. Os resultados da taxa de captura de células e viés de repetibilidade de esferas ConA sob diferentes temperaturas e tempos
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| 19810ES |