Vários tipos de esferas magnéticas em NGS: esferas magnéticas de DNA\RNA\mRNA
As esferas magnéticas são um dos produtos necessários na construção de bibliotecas de sequenciamento de alto rendimento. Elas podem purificar DNA ou RNA, rastrear fragmentos de DNA de tamanho alvo e enriquecer ácidos nucleicos alvo. Com o desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento, esferas magnéticas especializadas em diferentes campos de aplicação surgiram, incluindo esferas magnéticas de purificação de DNA, esferas magnéticas de seleção de tamanho de DNA, esferas magnéticas de purificação de RNA e esferas magnéticas de enriquecimento de mRNA. Então, quais são os princípios de várias contas magnéticas? Como escolher?
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1. Contas de DNA
2. Introdução às esferas de DNA estelar
3. Esferas de purificação de RNA
4. Esferas magnéticas enriquecidas com mRNA
5. Recomendação de produto de esferas magnéticas
1. ADN Contas
1.1 Princípios básicos
O princípio da purificação do ácido nucleico por esferas magnéticas é baseado na imobilização reversível em fase sólida (SPRI). Sob certas condições, o ácido nucleico é seletivamente ligado às esferas magnéticas, enquanto os poluentes permanecem na solução. Após a aplicação de um campo magnético, as esferas magnéticas que se ligam às moléculas alvo são separadas da solução e, em seguida, as esferas magnéticas são limpas para remover ainda mais os poluentes. Como a combinação de esferas magnéticas e moléculas de ácido nucleico é reversível, o ácido nucleico pode ser eluído das esferas magnéticas com um tampão de baixo teor de sal.
A superfície externa das esferas magnéticas é modificada com grupos funcionais hidroxila ou carboxila de silício. No sistema de tampão de purificação contendo PEG e íons de alto teor de sal, o DNA é ligado às esferas formando uma ponte iônica do grupo carboxila do íon sal de DNA. Essa ligação é reversível. A ponte iônica é removida no tampão TE sem PEG e íons de sal e, finalmente, o DNA é purificado. Com base nas esferas magnéticas carboxila, diferentes entradas de esferas magnéticas e tampões de purificação ligarão diferentes tamanhos de fragmentos. As esferas magnéticas ligam preferencialmente grandes fragmentos de DNA, então, na primeira rodada, as esferas magnéticas são usadas para ligar os fragmentos maiores do que o fragmento alvo, e o sobrenadante é retido; Na segunda rodada, as esferas magnéticas ligam o fragmento alvo no sobrenadante e então descartam o sobrenadante; Finalmente, o fragmento alvo é eluído das esferas magnéticas, que os fragmentos de DNA são do tamanho alvo.
Figura 1. Estrutura de esfera magnética carboxílica
Figura 2. Princípio da purificação de DNA por esferas magnéticas
1.2 Processo de operação
Figura 3. Etapas de purificação do DNA
Figura 4. Etapas de seleção do tamanho do DNA
1.3 Dicas para usar contas magnéticas
Melhor rendimento e seleção precisa do tamanho
(1) Misture bem antes de usar e equilibre deixe as esferas magnéticas em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.
——A solubilidade do PEG nas esferas magnéticas O tampão é facilmente afetado pelo pH e pela temperatura.Antes de usar, é necessário equilibrar à temperatura ambiente para fazer as esferas magnéticas uniformemente suspensas e o PEG totalmente dissolvido para evitar afetar os efeitos de adsorção e separação
(2) O tempo de adsorção deve ser suficiente e totalmente misturado para tornar a adsorção adequada;
(3) Lavagem com etanol 80% durante a purificação ou separação;
——Sob 80% de etanol, o ácido nucleico é desidratado e reunido de perto, e não se dissolve. As enzimas residuais, tampões, impurezas, etc. no sistema são limpos com etanol para obter um mais puro biblioteca.
(4) Durante a seleção do tamanho, confirme o volume da amostra para garantir que a proporção de adição de esferas magnéticas esteja correta;
——Durante a seleção do tamanho, é necessário inserir com precisão o volume correspondente de esferas magnéticas, para que a proporção seja precisa, porque a alteração da concentração de PEG e íons salinos no tampão pode afetar os resultados.
(5) Antes da etapa de eluição, deixe o álcool volatilizar completamente, mas evitar que as contas secagem excessiva
——Geralmente, pode ser seco em 2~3min. Quando o número de esferas magnéticas é grande e difícil de secar, Recomenda-se operar em múltiplos tubos de centrífuga.
(6) Se as esferas magnéticas estiverem aglomeradas ou em placas, o tempo de eluição pode ser estendido depois de misturar completamente;
——Pode ser causado por impurezas no DNA ou tempo de secagem muito longo. Geralmente, quando há muitas impurezas no DNA, é recomendado purificá-lo primeiro antes seleção de tamanho.
2. Introdução às esferas de DNA estelar
As esferas de seleção de DNA Hieff NGS™ são baseadas no princípio de SPRI (imobilização reversa de fase sólida), usando matérias-primas de esferas magnéticas importadas e um sistema de buffer otimizado, que pode ser usado para seleção e purificação do tamanho do fragmento de DNA durante a construção da biblioteca NGS. Elas são usadas da mesma forma que as esferas AMPure XP usadas, e a eficiência de recuperação de fragmentos e a distribuição do tamanho da biblioteca são altamente consistentes com elas.
2.1 Introdução ao desempenho da purificação
- Sistema de buffer exclusivo: fragmentos de DNA até 50bp podem ser recuperados.
- Alta taxa de recuperação: ≥90%.
- Remova impurezas com eficácia: Remova com eficácia impurezas como dímero de primer, dNTP, sal inorgânico e proteína.
- Ampla gama de aplicações: Adequado para purificação de DNA em cenários como digestão enzimática, ligação, clonagem e construção de biblioteca NGS.
Tabela 1. Eficiência de purificação e recuperação de DNA de esferas magnéticas com diferentes proporções
| Grupo de Experiência | Concentração de recuperação de esferas magnéticas neste lote (ng/μL) | Taxa de recuperação | Grupo de esferas AMPure XP (ng/μl) ④ | Taxa de recuperação | CV% | |||
| Razão | ① | ② | ③ | Média | ||||
| 1,8× | 22.2 | 23.4 | 22,8 | 22.8 | 96,92% | 22.2 | 94,37% | 2,55% |
| 0,8× | 20.2 | 19.3 | 18,5 | 19.33 | 82,19% | 17.8 | 75,67% | 6,52% |
| 0,6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71,42% | 16.2 | 68,87% | 2,55% |
Figura 5. Efeito de purificação dos resultados da eletroforese em gel de agarose com esferas magnéticas
M：Escada de DNA de 1kb;
2.2 Desempenho da seleção de tamanho
- Fácil para operar: o princípio de separação e a operação experimental são completamente consistentes com as esferas magnéticas XP
- Seleção precisa do tamanho: o tamanho dos fragmentos classificados é preciso e estável
- Ampla aplicabilidade: adequado para prédio Bibliotecas de DNA e RNA e adaptação para fragmentar a seleção do tamanho de vários tipos de amostra
- Desempenho de custo ultra-alto: qualidade estável, preço mais econômico, serviço de pré-venda e pós-venda mais atencioso
Figura 6. Resultados da seleção do tamanho do DNA
3. Esferas de purificação de RNA
O limpador de RNA Hieff NGS™ é baseado no princípio SPRI, que pode remover eficientemente proteínas, íons de sal e outras impurezas para obter amostras de RNA concentradas de alta pureza e otimizar cuidadosamente o sistema de tampão ácido para manter a estabilidade da estrutura do RNA e evitar a degradação do RNA. É adequado para construção de biblioteca de RNA, purificação de amostras de RNA total após remoção de rRNA, purificação de produtos de RNA transcritos in vitro, purificação de produtos marcados com RNA, purificação de RNA sintético, etc.
- Alta qualidade: matérias-primas importadas, qualidade altamente estável
- Sistema de buffer otimizado: garante a pureza e integridade do RNA e previne efetivamente a degradação do RNA
- Alta eficiência: recuperação eficiente, adequada para construção de biblioteca de RNA ou in vitro recuperação de produtos de transcrição, etc.
Figura 7. Eletroforetograma de diferentes amostras após purificação
4. Esferas magnéticas enriquecidas com mRNA
4.1 Princípio do isolamento do mRNA
As esferas magnéticas de separação e enriquecimento de mRNA são esferas magnéticas que são modificadas na superfície com oligo (dT). Por meio do princípio da hibridização, elas podem ligar especificamente o mRNA com a cauda Poly A e separar especificamente o mRNA do RNA total ou das células do tecido. Este kit com a fórmula otimizada do produto pode isolar eficientemente o mRNA completo de alta pureza do RNA de células e tecidos de animais, plantas, insetos e microrganismos eucarióticos.
Figura 8.princípio de enriquecimento e purificação de esferas magnéticas de mRNA
4.2 Desempenho de esferas de isolamento de mRNA
O Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit é desenvolvido independentemente pela
- Alta eficiência: a purificação do mRNA pode ser concluída em 45 minutos
- Alta pureza: esferas magnéticas oligo (dT) ligam-se especificamente ao mRNA
- Confiável: o mRNA obtido é adequado para NGS, in vitro tradução, RT-PCR e síntese de cDNA
Figura 9. Kit de isolamento de mRNA para purificação de mRNA de diferentes amostras de RNA
Nota: o rendimento do gene de manutenção representa o efeito da recuperação do mRNA. Rendimento do gene relacionado ao rRNA caracterização eficiência de remoção de rRNA
4.3 Perguntas frequentes sobre esferas magnéticas de mRNA
(1) Por que as esferas magnéticas se aglomeram e como resolver isso?
——Contas magnéticas a aglomeração reduzirá o rendimento e a pureza do mRNA. A amostra pode conter muitas impurezas, como polissacarídeos, proteínas e DNA de cadeia longa. Essas impurezas levarão a esferas magnéticas aglomeração. A solução é soprar as esferas magnéticas através de uma pipeta. O DNA genômico pode ser removido pelo tratamento com DNase antes da purificação. Se o tamanho da amostra inicial for muito grande e exceder a carga das esferas magnéticas, as esferas magnéticas também se aglomerarão. É recomendado operar de acordo com a quantidade de entrada no manual.
(2) Por que o rendimento do mRNA é baixo?
——Há muitas razões para o baixo rendimento de mRNA:
- O nível de expressão de mRNA de células ou tecidos é baixo, então podemos selecionar as amostras de período de expressão apropriadas ou aumentar adequadamente a quantidade total de RNA da amostra.
- A proporção de esferas magnéticas para amostras é muito baixa, o que afeta a combinação de mRNA e esferas magnéticas. Tente aumentar o número de esferas magnéticas ou reduzir a quantidade e o volume de entrada da amostra.
- O tempo de hibridização é muito curto, o tempo de incubação pode ser aumentado para 10-15min;
- A eluição é insuficiente, é necessário aumentar adequadamente o volume do tampão de eluição, aumentar o tempo e a temperatura de eluição ou repetir a etapa de eluição duas vezes.
(3) Como eliminar o rRNA de forma eficaz?
——Se a operação for inadequada, o rRNA será ligado de forma não específica às esferas magnéticas junto com o mRNA durante a purificação, especialmente quando há uma grande quantidade de entrada total de RNA. Duas rodadas de ligação são geralmente usadas no processo de purificação para evitar efetivamente a poluição do rRNA. Certifique-se de que esteja completamente misturado durante o experimento de lavagem para remover a ligação não específica e tentar remover a poluição do rRNA.
(4) Para muitas aplicações posteriores, é necessário eluir o mRNA e as esferas magnéticas interferirão nas reações enzimáticas posteriores?
——Algumas reações posteriores podem ser realizadas diretamente com esferas magnéticas sem eluir mRNAs, como fragmentação de mRNA e transcrição reversa na construção de bibliotecas de RNA.No entanto, se as reações de PCR forem realizadas, é necessário garantir que não haja poluição do DNA genômico, caso contrário, muitos fragmentos de amplificação genômica serão gerados, o que interferirá nos resultados experimentais. Operações detalhadas podem ser realizadas de acordo com as instruções das reações downstream correspondentes, como a construção da biblioteca de RNA-Seq
(5) O kit pode separar o mRNA diretamente de células ou tecidos?
——Não recomendo! O lisado contém alguns componentes que afetarão a ligação do mRNA. É recomendado usar um kit especial.
5. Recomendação de produto de esferas magnéticas Yeasen
As esferas magnéticas da série Hieff NGS™ como produtos
Tabela 2. Recomendação de produto de esferas magnéticas
| Nome do produto | Gato# | Especificação | Cenários de uso e aplicação |
| Hieff NGS™ Contas de seleção de DNA | 12601ES03 | 1 mL | 👉ADN NGS purificação e seleção de tamanho 👉Purificação de produtos de PCR 👉Purificação de produtos de digestão e ligação enzimática |
| 12601ES08 | 5 mL | ||
| 12601ES56 | 60 mL | ||
| 12601ES75 | 450 mL | ||
| Hieff NGS™ Limpador de RNA | 12602ES03 | 1 mL | 👉Purificação de RNA 👉Purificação de amostras de RNA total após remoção de rRNA 👉Purificação de produtos marcados com RNA |
| 12602ES08 | 5 mL | ||
| 12602ES56 | 60 mL | ||
| 12602ES75 | 450 mL | ||
| Kit mestre de isolamento de mRNA Hieff NGS™ | 12603ES24 | 24 T | 👉Isolamento e purificação de mRNA 👉Purificação de mRNA de transcrição in vitro |
| 12603ES96 | 96 T |
Sobre a leitura
O quanto você sabe sobre tecnologia relacionada a NGS?
5 minutos para entender o passado e o presente das esferas de seleção de DNA (incluindo análise de resultados e interpretação de perguntas frequentes)