Введение в апоптоз
Апоптоз — это явление запрограммированной гибели клеток, которое происходит во время развития клетки или когда на нее влияют определенные факторы, и запускается регуляцией внутриклеточных генов и их продуктов. В пути апоптоза события происходят в хронологическом порядке, одно за другим, что приводит к появлению апоптотических пузырьков, а затем происходит апоптоз. Апоптоз играет решающую роль в эмбриональном развитии и морфогенезе, поддержании стабильной популяции нормальных клеток в тканях, защите организма и иммунных реакциях, повреждении клеток, вызванном болезнью или интоксикацией, старением и развитием опухолей, и имеет потенциальную терапевтическую ценность.
Принцип обнаружения
Распределение фосфолипидов в нормальных клеточных мембранах асимметрично. фосфатидилсерин (PS) находится на внутренней поверхности клеточной мембраны в живых клетках, и во время апоптоза клеточная мембрана претерпевает изменение, и PS переворачивается с внутренней поверхности клеточной мембраны на внешнюю поверхность клеточной мембраны. Аннексин V специфически распознает PS на поверхности апоптотических клеток, тогда как PS из живых клеток находится на внутренней поверхности клеточной мембраны и не способен специфически связываться с Аннексином V.
PS некротических клеток также переворачивается с внутренней поверхности клеточной мембраны на внешнюю поверхность клеточной мембраны, и Annexin V также распознает PS на поверхности некротических клеток, поэтому Annexin V не способен различать некротические и апоптотические клетки. Напротив, краситель PI был способен связываться с внутриклеточной ДНК и различать некротические клетки и живые клетки. Клеточная мембрана ранних апоптотических клеток и живых клеток все еще нетронута, и краситель PI не может свободно проходить через клеточную мембрану, чтобы войти в клетку и связаться с ДНК, поэтому краситель PI не может маркировать апоптотические клетки и живые клетки, в то время как краситель PI способен проходить через клеточную мембрану некротических клеток и связываться с ДНК внутри клетки, а краситель PI в некротических клетках будет испускать красную флуоресценцию после возбуждения лазером 488 нм, которая будет получена соответствующим каналом. Таким образом, аннексин V и PI можно использовать одновременно для различения живых клеток, ранних апоптотических клеток и поздних апоптотических или некротических клеток.
Рис. 2 Принцип обнаружения аннексина V/PI
Обнаружение методом проточной цитометрии
Максимальная длина волны возбуждения FITC составляет 488 нм, максимальная длина волны испускания — 525 нм, а зеленая флуоресценция FITC обнаруживается в канале FL1. Максимальная длина волны возбуждения комплекса PI-ДНК составляет 535 нм, максимальная длина волны испускания составляет 615 нм, а красная флуоресценция PI обнаруживается в канале FL2 или FL3. Анализ проводился с помощью программного обеспечения, такого как CellQuest, и была построена двухцветная диаграмма рассеяния с FITC в качестве горизонтальной координаты и PI в качестве вертикальной координаты. В типичных экспериментах клетки можно разделить на три субпопуляции, при этом живые клетки имеют только очень слабую фоновую флуоресценцию, ранние апоптотические клетки имеют только сильную зеленую флуоресценцию, а поздние апоптотические клетки имеют двойное окрашивание зеленой и красной флуоресценцией.
Рис.3. Детекция методом проточной цитометрии
Часто задаваемые вопросы
В: Можно ли применять анализ апоптоза с использованием аннексина V к растениям или бактериям (прокариотам)?
A: Да, но необходимо подготовить протопласты, поскольку растительные клетки или бактерии (прокариоты) содержат клеточные стенки. Конкретная дозировка окрашивающего раствора нужна только для погружения клеток, а время окрашивания несколько отличается для разных клеток.
В: Как оценить результат эксперимента?
A: Живые клетки (аннексин V-/PI-), ранние апоптотические клетки (аннексин V+/PI-), поздние апоптотические клетки и некротические клетки демонстрируют двойную позитивность (аннексин V+/PI+), голые ядра (аннексин V-/PI+).
В: В чем разница между Аннексином V и TUNEL?
A: Маркировка концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL) — это метод окрашивания, используемый для выявления участков фрагментации внутриклеточной ДНК — отличительной черты позднего апоптоза.
Окрашивание аннексином V распознает ранние стадии апоптоза путем связывания с остатками PS, экспонированными снаружи клетки из-за потери асимметрии клеточной мембраны.
В: Возможно ли провести анализ, используя только Annexin V-FITC, без обнаружения PI?
A: Да, это возможно. Для специальных тестовых образцов, таких как эритроциты без ядер или использование препарата доксорубицин (адриамицин), который мешает обнаружению ПИ, можно провести анализ, используя только Annexin V-FITC в обоих случаях.
Подробная информация о продукте
| Название продукта | Номер товара | Спецификация |
| Набор для обнаружения апоптоза Аннексин V-FITC/7-AAD | 40311ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т |
| 40302ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т | |
| Набор для обнаружения апоптоза аннексина V-PE/7-AAD | 40310ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т |
| 40303ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т | |
| Набор для обнаружения апоптоза Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD | 40313ES60 | 100т |
| 40305ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т | |
| 40304ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т | |
| Набор для обнаружения апоптоза Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD | 40312ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т |
| 40306ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т | |
| 40307ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т | |
| 40308ES20/50/60 | 20Т/50Т/100Т |