В последние годы, с быстрым развитием биомедицины, появлением клеточной и генной терапии в условиях пандемии COVID-19 и появлением вакцин мРНК, обеспечение безопасности и надежности биологических продуктов стало фокусом внимания правительств и регулирующих органов по всему миру. Загрязнение микоплазмой является распространенным, но обычно сложным для устранения типом загрязнения. Нормативные требования предписывают «обеспечение отсутствия загрязнения микоплазмой» для биопроцессов, включающих культивирование клеток.
Требования регулирующих органов к тестированию на микоплазму:
- «Руководство для промышленности: характеристика и квалификация клеточных субстратов и других биологических материалов, используемых при производстве вирусных вакцин для лечения инфекционных заболеваний» FDA предусматривает контроль микоплазмы в сырье, вирусных семенах и необработанных жидкостях урожая.
- Часть III Китайской фармакопеи 2020 года «Подготовка и контроль качества субстратов животных клеток, используемых для испытаний при производстве биологических продуктов» требует проведения испытаний на микоплазму производственных клеток, включая основные банки клеток (MCB), рабочие банки клеток (WCB) и клетки на завершающем этапе производства (EOPC).
- «Технические руководящие принципы для фармацевтических исследований и оценки продуктов иммуноклеточной терапии (испытания)» рекомендуют проводить тестирование безопасности микоплазмы на подходящих промежуточных образцах в ключевые моменты времени или применять соответствующие меры контроля. Тестирование микоплазмы также требуется в качестве теста на выпуск для конечных продуктов.
Тестирование нуклеиновых кислот (NAT) и традиционные методы:
До появления методов быстрого обнаружения, таких как технология амплификации нуклеиновых кислот (NAT), использовались традиционные методы культивирования и анализы индикаторных клеток. Однако из-за длительных циклов обнаружения или проблем с чувствительностью эти методы часто удлиняли циклы производства или выпуска или требовали условного выпуска клеточных материалов на основе оценки риска или исследования альтернативных методов. С развитием клеточной и генной терапии в отрасли растет спрос на методы обнаружения микоплазмы с более высокой своевременностью и чувствительностью. Короткий срок хранения продуктов не может выдерживать длительные периоды тестирования, поэтому методы NAT стали выгодной альтернативой.
В настоящее время Европейская фармакопея (EP) <2.6.7>, Японская фармакопея (JP) и Фармакопея США (USP) <63> включили методы NAT в качестве методов обнаружения микоплазмы. Однако валидация этого метода и сравнение с традиционными методами для обеспечения его не меньшей чувствительности являются предварительными условиями для его использования. Хотя издание Китайской фармакопеи (ChP) 2020 года не включило NAT в качестве метода обнаружения микоплазмы, в нем упоминается возможность использования «других методов, признанных национальным органом по регулированию лекарственных средств». В мае 2022 года Центр по рассмотрению лекарственных средств Национального управления по контролю за лекарственными средствами (NMPA) выпустил «Технические руководящие принципы для фармацевтических исследований и оценки продуктов иммуноклеточной терапии (испытание)», в которых предлагается рассмотреть возможность разработки новых стерильных и методов обнаружения микоплазмы для тестирования выпуска в особых обстоятельствах, когда объем образца ограничен или требуется быстрое высвобождение, а фармакопейные методы неадекватны. Таким образом, ожидается, что методы NAT будут все чаще использоваться поставщиками сырья и компаниями, выпускающими лекарственные средства передовой терапии (ATMP), в качестве метода, позволяющего проводить быстрое тестирование на высвобождение микоплазмы.
Метод NAT — Требования к валидации метода
Процесс валидации методов NAT подробно описан в Европейской Фармакопее <2.6.7> и Японской фармакопеей, содержание которых в основном согласуется. Национальный институт по контролю за продуктами питания и лекарствами (NIFDC) также опубликовал статью под названием «Соображения относительно методов обнаружения нуклеиновых кислот и методологической валидации для исследования микоплазмы», направленную на предоставление руководства для разработчиков и пользователей методов амплификации нуклеиновых кислот микоплазмы в Китае. Специфичность, предел обнаружения и надежность имеют важное значение для валидации методов NAT для микоплазмы. Если для обнаружения микоплазмы используются коммерческие наборы, валидация пригодности метода может быть проведена на основе всеобъемлющего отчета поставщика о производительности набора в сочетании с лабораторной средой и типом образца.
Специфика:
Специфичность относится к способности аналитического метода точно определять аналит в присутствии других компонентов (таких как примеси, продукты деградации, вспомогательные вещества и т. д.). EP подчеркивает необходимость сосредоточиться на перекрестных реакциях между другими видами бактерий, тесно связанными с филогенетическим деревом, такими как Clostridium, Lactobacillus и Streptococcus в пределах грамположительных бактерий. Следует также уделять внимание распространенным типам загрязнителей, таким как загрязнение человеческой ДНК в клетках-хозяевах и экспериментальных средах.
Предел обнаружения:
Предел обнаружения — это наименьшее количество аналита, которое может быть обнаружено в образце. Он служит качественной основой идентификации и не требует количественной оценки в виде точного значения. EP требует 24 точек данных обнаружения для каждого вида микоплазмы при каждой концентрации разбавления. Этого можно достичь, выполнив три независимых 10-кратных серийных разбавления в разные дни с восемью повторными обнаружениями для каждого градиента разбавления или выполнив четыре независимых 10-кратных серийных разбавления в разные дни с шестью повторными обнаружениями для каждого градиента разбавления. Уровень положительности обнаружения более 95% можно считать пределом обнаружения. Для типов микоплазм, требующих подтверждения предела обнаружения, производителям наборов необходимо охватить как можно больше типов микоплазм, как того требуют регулирующие фармакопеи, и изучить пределы обнаружения для каждого типа микоплазмы. Биофармацевтическим компаниям рекомендуется также учитывать типы человеческих микоплазм.
- Если в процессе производства используются или встречаются птичьи клетки или материалы, необходимо провести проверку предела обнаружения Mycoplasma synoviae.
- Если в процессе производства используются или встречаются материалы из насекомых или растений, необходимо провести проверку предела обнаружения Acholeplasma.
- Свиная назальная микоплазма широко распространена в образцах, загрязненных микоплазмой, и привлекла внимание Китайского института по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами.
В отличие от Европейской фармакопеи, в Японской фармакопее не упоминается птичья микоплазма, для которой требуется проверка предела обнаружения, но включена слюнная микоплазма.
Надежность:
Надежность относится к способности метода выдерживать небольшие изменения условий измерения без ущерба для себя, что обеспечивает основу для использования установленного метода в рутинном тестировании. Оценка надежности должна быть сосредоточена на устойчивости методов обнаружения микоплазмы к изменениям концентрации MgCl2, праймеров и dNTP в реагентах для обнаружения, изменениям в наборах для экстракции нуклеиновых кислот или этапах экстракции, а также использованию различных усилителей нуклеиновых кислот.
Сравнительное исследование
Если NAT планируется использовать в качестве замены фармакопейным методам, необходимо путем сравнения подтвердить, что NAT может заменить методы, основанные на культуре, или методы культивирования индикаторных клеток.Обычно это предполагает рассмотрение предела обнаружения метода, а также специфичности (например, диапазона покрытия микоплазмы и возможных ложных положительных результатов). Для сравнения пределов обнаружения он должен соответствовать критериям, что «предел обнаружения 10 КОЕ/мл может заменить методы, основанные на культуре, а предел обнаружения 100 КОЕ/мл может заменить методы культуры индикаторных клеток».
Существует два возможных подхода к проведению сравнительных исследований:
- Проведение синхронных экспериментов с использованием одних и тех же проверенных штаммов микоплазм как для NAT, так и для фармакопейных методов для подтверждения предела обнаружения.
- Сравнение результатов валидации NAT с результатами валидации предыдущих фармакопейных методов, однако требуется тщательное документирование файлов подтверждения для стандартов микоплазмы, используемых в обоих методах.
NAT Mycoplasma qPCR Detection - комплексное решение
Сопутствующие товары
Набор для анализа Yeasen MycAway™ Mycoplasma qPCR (метод зондирования) — это продукт для быстрого качественного обнаружения на основе NAT (методы амплификации нуклеиновых кислот) потенциального заражения микоплазмой сырья, банков клеток, вирусных семян, жидкостей сбора вирусов или клеток и терапевтических клеток. Этот набор, основанный на технологии количественной ПЦР, использует флуоресцентные зонды Taqman для качественного обнаружения ДНК микоплазмы в тестовом образце, охватывая более 160 последовательностей ДНК микоплазмы. Он строго соответствует рекомендациям и требованиям EP 2.6.7 и JP G3 для обнаружения микоплазмы, демонстрируя высокую чувствительность, хорошую специфичность и безопасность. Его можно использовать вместе с набором для предварительной обработки образцов остаточной ДНК с магнитными шариками MolPure® для ручного извлечения образцов или автоматического извлечения нуклеиновых кислот с использованием полностью автоматического экстрактора нуклеиновых кислот Auto-Pure 32A. После предварительной обработки образца для удаления мешающих примесей и получения очищенной ДНК микоплазмы сигнал флуоресценции зонда собирается с помощью количественной ПЦР для определения результата обнаружения.
Технические услуги
- Предоставление комплексных отчетов о проверке тест-набора MycAway™ Mycoplasma qPCR.
- Предоставление технических услуг по проверке применимости образцов клиентов.
- Предоставление аудиторской поддержки.
| Описание | Номер детали |
| Набор для подготовки образцов остаточной магнитной ДНК MolPure® | 18461ES |
| Набор для обнаружения микоплазмы методом ПЦР MycAway™ (2G) | 40619ES |