Under de senaste åren, med den snabba utvecklingen av biomedicin, framväxten av cell- och genterapier under covid-19-pandemin, och tillkomsten av mRNA-vacciner, har säkerställandet av säkerheten och tillförlitligheten för biologiska produkter blivit en samlingspunkt för regeringar och tillsynsorgan över hela världen. Mykoplasmakontamination är en vanlig men typiskt utmanande typ av kontaminering att eliminera. Regulatoriska krav kräver att "säkerställa att ingen mykoplasmakontamination" för bioprocesser som involverar cellodling.
Tillsynsmyndigheternas krav för mykoplasmatester:
- FDA:s "Guidance for Industry: Karakterisering och kvalificering av cellsubstrat och andra biologiska material som används vid framställning av virusvacciner för indikationer på infektionssjukdomar" stipulerar mykoplasmakontroll för råvaror, virala frön och obearbetade skördevätskor.
- 2020-utgåvan av den kinesiska farmakopén del III "Förberedelse och kvalitetskontroll av animaliska cellsubstrat som används för testning av biologisk produktproduktion" kräver mykoplasmatester för produktionsceller, inklusive Master Cell Banks (MCB), Working Cell Banks (WCB) och End-of-Production Cells (EOPC).
- De "Tekniska riktlinjerna för läkemedelsforskning och utvärdering av produkter för immuncellsterapi (prövning)" rekommenderar att man genomför mykoplasma säkerhetsrelaterade tester på lämpliga mellanprover vid viktiga tidpunkter eller implementerar relevanta åtgärder för kontroll. Mykoplasmatester krävs också som ett frisättningstest för slutprodukter.
Nukleinsyratestning (NAT) och traditionella metoder:
Innan tillkomsten av snabba detektionsmetoder såsom Nucleic Acid Amplification Technology (NAT) användes traditionella odlingsmetoder och indikatorcellsanalyser. Men på grund av långa upptäcktscykler eller känslighetsproblem förlängde dessa metoder ofta produktions- eller frisättningscykler eller nödvändiggjorde villkorad frisättning av cellmaterial baserat på riskbedömning eller utforskning av alternativa metoder. Med utvecklingen av cell- och genterapier finns det en ökande efterfrågan inom branschen på metoder för att detektera mykoplasma med högre aktualitet och känslighet. Produkternas korta hållbarhet kan inte hålla långa testperioder, så NAT-metoder har dykt upp som gynnsamma alternativ.
För närvarande har den europeiska farmakopén (EP) <2.6.7>, den japanska farmakopén (JP) och den amerikanska farmakopén (USP) <63> alla inkluderat NAT-metoder som mykoplasmadetektionsmetoder. Validering av denna metod och jämförelse med traditionella metoder för att säkerställa att dess känslighet inte är sämre är dock förutsättningar för dess användning. Även om 2020-utgåvan av den kinesiska farmakopén (ChP) inte har inkluderat NAT som en metod för att detektera mykoplasma, nämner den möjligheten att använda "andra metoder som erkänns av den nationella läkemedelsmyndigheten." I maj 2022 släppte Drug Review Center vid National Medical Products Administration (NMPA) "Technical Guidelines for Pharmaceutical Research and Evaluation of Immune Cell Therapy Products (Trial)," som föreslår att man överväger utvecklingen av nya metoder för att detektera sterila och mykoplasma för frisättningstestning under speciella omständigheter när provvolymen är begränsad eller snabb frisättning krävs i farmakokatisk metod. Därför förväntas NAT-metoder användas i allt större utsträckning av fler råvaruleverantörer och ATMP-företag (Advanced Therapy Medicinal Product) som en metod som kan stödja snabb testning av mykoplasmafrisättning.
NAT-metod - Metodvalideringskrav
Valideringsprocessen för NAT-metoder beskrivs utförligt i European Pharmacopoeia <2,6.7> och den japanska farmakopén, med deras innehåll i huvudsak konsekvent. National Institutes for Food and Drug Control (NIFDC) har också publicerat en artikel med titeln "Considerations on Nucleic Acid Detection Methods and Methodological Validation for Mycoplasma Examination", som syftar till att ge vägledning för utvecklare och användare av mycoplasma-nukleinsyraförstärkningsmetoder i Kina. Specificitet, detektionsgräns och robusthet är avgörande för att validera mycoplasma NAT-metoder. Om kommersiella kit används för mycoplasma-detektion, kan metodlämplighetsvalidering utföras baserat på leverantörens omfattande kit prestandarapport, kombinerat med laboratoriemiljö och provtyp.
Specificitet:
Specificitet avser förmågan hos en analysmetod att exakt bestämma analyten i närvaro av andra komponenter (såsom föroreningar, nedbrytningsprodukter, hjälpämnen, etc.). EP betonar behovet av att fokusera på korsreaktioner mellan andra bakteriearter som är nära besläktade med det fylogenetiska trädet, såsom Clostridium, Lactobacillus och Streptococcus inom de grampositiva bakterierna. Uppmärksamhet bör också ägnas åt vanliga föroreningstyper som mänsklig DNA-kontamination i värdceller och experimentella miljöer.
Detektionsgräns:
Detektionsgränsen är den lägsta mängd analyt som kan detekteras i ett prov. Den fungerar som en kvalitativ identifieringsgrund och behöver inte kvantifieras som ett exakt värde. EP kräver 24 detektionsdatapunkter för varje mykoplasmaart vid varje spädningskoncentration. Detta kan uppnås genom att utföra tre oberoende 10-faldiga serieutspädningar på olika dagar, med åtta upprepade detektioner för varje utspädningsgradient, eller genom att utföra fyra oberoende 10-faldiga serieutspädningar på olika dagar, med sex upprepade detektioner för varje utspädningsgradient. En detekteringspositivitet på över 95 % kan betraktas som detektionsgränsen. För mykoplasmatyper som kräver bekräftelse av detektionsgränsen, måste kittillverkarna täcka så många mykoplasmatyper som möjligt som krävs enligt regulatoriska farmakopéer och utforska detektionsgränserna för varje mykoplasmatyp. För biofarmaceutiska företag är det tillrådligt att även överväga humana mykoplasmatyper.
- Om fågelceller eller -material används eller påträffas under produktionsprocessen, bör verifiering av detektionsgränsen för Mycoplasma synoviae utföras.
- Om insekts- eller växtmaterial används eller påträffas under produktionsprocessen, bör verifiering av detektionsgränsen för Acholeplasma utföras.
- Porcin nasal mykoplasma är mycket utbredd i mykoplasma-kontaminerade prover och har uppmärksammats från China Institute for Food and Drug Control.
I jämförelse med den europeiska farmakopén nämner den japanska farmakopén inte fågelmykoplasma för vilken det krävs verifiering av detektionsgränsen utan inkluderar salivmykoplasma.
Robusthet:
Med robusthet avses en metods förmåga att motstå små variationer i mätförhållanden utan att påverkas, vilket ger underlag för den etablerade metodens användning vid rutinprovning. Utvärdering av robusthet bör fokusera på toleransen för mykoplasmadetektionsmetoder för variationer i koncentrationen av MgCl2, primers och dNTPs i detektionsreagenser, förändringar i nukleinsyraextraktionssatser eller extraktionssteg och användningen av olika nukleinsyraförstärkare.
Jämförbarhetsstudie
Om NAT ska användas som ersättning för farmakopémetoder är det nödvändigt att genom jämförelse bekräfta att NAT kan ersätta odlingsbaserade metoder eller indikatorcellodlingsmetoder.Detta innebär vanligtvis att man beaktar metodens detektionsgräns, såväl som specificitet (såsom omfattningen av mykoplasmatäckning och möjliga falska positiva). För att jämföra detektionsgränser bör det uppfylla kriterierna att "en detektionsgräns på 10 CFU/mL kan ersätta odlingsbaserade metoder och en detektionsgräns på 100 CFU/mL kan ersätta metoder för indikatorcellodling."
Det finns två valfria metoder för att genomföra jämförbarhetsstudier:
- Genomföra synkrona experiment med samma validerade mykoplasma-stammar för både NAT- och farmakopémetoder för att bekräfta detektionsgränsen.
- Jämförelse av resultaten av NAT-validering med tidigare farmakopéiska metodvalideringsresultat, men noggrann dokumentation av bekräftelsefilerna för de mykoplasmastandarder som används i båda metoderna krävs.
NAT Mycoplasma qPCR-detektion - omfattande lösning
Relaterade produkter
Yeasen MycAway™ Mycoplasma qPCR Test Kit (sondmetod) är en snabb kvalitativ detektionsprodukt baserad på NAT (nukleinsyraamplifieringstekniker) för potentiell mykoplasmakontamination i råmaterial, cellbanker, virala frön, virus- eller cellskördevätskor och terapeutiska celler. Detta kit, baserat på kvantitativ PCR-teknologi, använder Taqman-fluorescenssonder för att kvalitativt detektera mykoplasma-DNA i testprovet, som täcker över 160 mykoplasma-DNA-sekvenser. Den följer strikt riktlinjerna och kraven i EP 2.6.7 och JP G3 för mykoplasmadetektion, vilket visar hög känslighet, god specificitet och säkerhet. Den kan användas i kombination med MolPure® Magnetic Bead Residual DNA Sample Pretreatment Kit för att manuellt extrahera prover eller automatiskt extrahera nukleinsyror med Auto-Pure 32A helautomatisk nukleinsyraextraktor. Efter provförbehandling för att avlägsna störande föroreningar och erhålla renat mykoplasma-DNA, samlas fluorescenssignalen från sonden in genom qPCR för att bestämma detektionsresultatet.
Tekniska tjänster
- Tillhandahåller omfattande valideringsrapporter för MycAway™ Mycoplasma qPCR Test Kit.
- Tillhandahålla tekniska tjänster för validering av klientexempel tillämplighet.
- Tillhandahålla revisionsstöd.
| Beskrivning | Artikelnummer |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mycoplasma qPCR-detektionskit (2G) | 40619ES |