E.Coli Host Cell DNA Rest Detection Kit (2G) Valideringsrapport

E.coli Värdcells-DNA-restdetektionskit (2G)

Kvalifikationssammanfattning (Katnummer: 41308ES60)

1. Bakgrund

Data som sammanfattas i denna rapport är utförda av Yeasen Biotechnology för produkten 'E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G). Sammanfattningsdata är endast för användarens referens, och användaren måste verifiera värdcellsresten DNA-metoden genom att använda sina egna prover för att bekräfta att metoden kan uppfylla användarens krav. Alla laboratorier som använder detta kit rekommenderas att verifiera följande parametrar: Linjäritet, Område, Noggrannhet, Precision, Kvantifieringsgräns, Specificitet och Robusthet.

Yeasen Biotechnology kan tillhandahålla den detaljerade kvalificeringsrapporten för detta kit. Om användaren använder den här rapporten är det bara lämpligheten (som inkluderade Precision, Noggrannhet och specificitet) bör verifieras.

2. Experimentella material och metoder

2.1 E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G), leverantör: Yeasen, Kat.nr.: 41308ES60.

2.2 MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit, leverantör: Yeasen, Kat.nr.: 18461ES60.

2.3 Nationell standard för E.coli DNA-innehåll: Kat. 270027, varunummer: 201101, koncentration: 96,2 μg/mL, lagringsvillkor: -70 ℃, köpt från: National Institutes for Food and Drug Control.

2.4 Originaldata: den elektroniska versionen registrerades i "Experimentell rapport" underfilen till den överordnade filen 'E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)'.

2.5 Metoder: Materialen och operationsmetoderna som användes för experimentet har i princip producerats eller fastställts av Yeasen Biotechnology, som utvärderades och verifierades under lång tid, utvecklingen och tillverkningen av satsen följs enligt ISO 13485-systemet.

3. Kvalifikationens innehåll och resultat

3.1 Detektionsområde

Det linjära området för kitet var 30 fg/μL~300 pg/μL med R²=1, och amplifieringseffektiviteten var 101,74% med CV <15% för varje koncentrationsanalys.

Figur 1 E.coli DNA (2G) qPCR Standard Curve

3.2 Noggrannhet

3.2.1 Avvikelse från Nationell standard för E.coli DNA-innehåll

E.coli DNA-referensmaterialet i varje batch av kitet kalibrerades med hjälp av den nationella standarden för E.coli-DNA-innehåll. Yeasen DNA-referensmaterial var i princip fritt från avvikelser från den nationella standarden för E.coli-DNA-innehåll kalibreringskurva och avvikelsen för analysvärdet var <5 %.

3.2.2 Råterhämtning

3.2.2.1 Experiment för återhämtning av tomprovsspik

Prover av E.coli DNA-standarder i höga och låga koncentrationer: 300 pg/μL, 3 pg/μL respektive 30 fg/μL preparerades och analyserades efter extraktion med hjälp av den magnetiska pärlmetoden för resterande DNA-prov Pre-treatment Kit (2 extraktionsreplikat utfördes för varje analysprov och 3 extraktionsreplikat), och CV:n analyserades.

För olika koncentrationer av DNA-prov varierade återvinningarna från 70 % till 130 %, och CV:n var alla <20 %.

Provtyp	Teoretisk koncentration	Extrahera 1 medelvärde	Extrahera 2 medelvärde	Genomsnittlig koncentration	CV	Återhämtning
Tomt prov	/	/	/	/	/	/
Återvinningsprov 1	300 pg/μL	250,56 pg/μL	262,11 pg/μL	256,33 pg/μL	4,41 %	85,44 %
Återvinningsprov 2	3 pg/μL	2,29 pg/μL	2,56 pg/μL	2,42 pg/μL	7,09 %	80,77 %
Återvinningsprov 3	30 fg/μL	33,62 fg/μL	32,61 fg/μL	33.12 fg/μL	14,28 %	110,39 %

Tabell 1 Återställning av tomprovsspik

3.2.2.2 Simulerat provspikåterställningsexperiment

Prover med samma koncentration (3 pg/μL E.coli-DNA) extraherades (2 extraktionsreplikat utfördes för varje prov och 3 analysreplikat gjordes för varje extraktion) med 5 olika bakgrundslösningar (högt protein, hög nukleinsyra, högt och lågt pH, högt salt) och provåtervinning och CV analyserades.

DNA-prover för olika bakgrundslösningar varierade från 70 % till 130 %, med alla CV:n <20 %.

Provtyp	Teoretisk koncentration	Extrahera 1 medelvärde	Extrahera 2 medelvärde	Genomsnittlig koncentration	CV	Återhämtning
Grundprov	/	/	/	/	/	/
Högt protein	3 pg/μL	2,25	2.23	2.24	1,09 %	74,74 %
Hög kärnsyra		3,93	3,96	3,95	1,56 %	131,52 %
Högsalt		2,69	2,67	2,68	2,63	89,20 %
Högt pH		2,90	3,67	3.29	13,82 %	109,55 %
Lågt pH		2,77	2,87	2,82	3,41 %	94,01 %

Tabell 2 Grundläggande prov återhämtning av spik

3.3 Precision

3.3.1 Repeterbarhet

Upprepa analysen 10 gånger för E.coli DNA-standarder vid en koncentration av 3 pg/μL med en CV <15%.

Upprepningar	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	Betyda	CV
Detektionsvärde (fg/μL)	3.16	2,87	2,97	2,86	2,81	2,97	3.14	3.21	3.14	3.1	3.02	4,78 %

Tabell 3 Upprepningsresultat

3.3.2 Mellanprecision

Tre experimentörer testade oberoende E.coli DNA-standardprover vid höga och låga koncentrationer: 300 pg/μL, 3 pg/μL och 30 fg/μL, och tre replikat gjordes för varje koncentration, och CV för alla nio erhållna data var <15 %.

Exp	Faktisk koncentration Teoretisk koncentration	E.coli-DNA (2G)
		300 pg/uL	3 pg/ul	30 fg/uL
Exp 1	Beslutsamhet 1	295,65	3.22	26,90
	Beslutsamhet 2	287,71	3.24	32.00
	Beslutsamhet 3	300,23	3.17	27.50
Exp 2	Beslutsamhet 4	306,06	3.13	37.30
	Beslutsamhet 5	299,76	3.02	32,70
	Beslutsamhet 6	299.63	3.02	34.00
Exp 3	Beslutsamhet 7	266,70	3.01	35,90
	Beslutsamhet 8	272,89	3.09	40,70
	Beslutsamhet 9	276,51	3.01	35,20
/	Betyda	289,46	3.10	33,60
/	CV	4,89 %	3,02 %	13,18 %

Tabell 4 Resultat med medelprecision

3.4 Specificitet

Interferensen av cellulärt genomiskt DNA som vanligtvis används i produktionen av biologiska läkemedel bedömdes för interferens med E.coli DNA-detektionsreagens, och interferensgruppen överlappade kontrollgruppen och ingen interferens sågs (figuren nedan visar, i ordning, interferensdata för HEK293, Vero och CHO genomiska DNA med E.coli DNA-detektionsreagens).

Figur 2 Interferensexperimentresultat

3.5 Kvantifieringsgräns

E.coli-DNA detekterades vid 50 fg/μL, 40 fg/μL, 30 fg/μL, 10 fg/μL och 5 fg/μL, med 10 replikat för varje koncentration. Resultaten visade att CV var <20 % vid koncentrationer på 30 fg/μL och över. Det vill säga gränsen för kvantifiering av E.coli-värdcells-DNA-resterdetektionskit (2G) var 30 fg/μL.

Upprepningar Testobjekt	E.coli-DNA (2G) (fg/μL)
	Kvantitet	Omräkningsförhållande
1	29,43	98,09 %
2	29,51	98,35 %
3	32.04	106,79 %
4	26.07	86,89 %
5	34.06	113,53 %
6	33,54	111,79 %
7	26,95	89,82 %
8	27.38	91,26 %
9	27.04	90,13 %
10	26.10	87,02 %
Betyda	29.21	/
CV	10,40 %	/

Figur 3 30fg/μL E.coli DNA (2G) qPCR-testresultat

3.6 Robusthet

Detta kit har testats och är lämpligt för, men inte begränsat till, följande instrument:

Försäljare	Instrumentmodeller	Amplifieringseffektivitet	R2	Kvantifieringsgräns (fg/μL)	CV
Termo	ABI 7500	101,74 %	1	30	13,30 %
Termo	ABI QuantStudio5	100,46 %	1	30	12,40 %
Bio-Rad	CFX96	99,20 %	0,999	30	13,76 %
Shanghai Hongshi	SLAN	100,40 %	0,999	30	11,67 %

Tabell 5 Testresultat för instrumentets lämplighet

3.7 Stabilitet

3.7.1 Frys-tina stabilitet

E.coli värdcells-DNA-restdetektionskit (2G) testades genom upprepad frysning och upptining 10 gånger, och satsens prestanda påverkades inte.

Testindikatorer Frys-tina tider	Parameter	T0 tid	Frys-tina 10 gånger
Standardkurvaparameter	Amplifieringseffektivitet	98,23 %	100,20 %
	R2	1	0,999
Kvantifieringsgräns (30 fg/μL)	CV	15,07 %	9,66 %

Tabell 6 Analys av frys-upptining stabilitetsresultat

3.7.2 Accelererad stabilitet

E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G) förvarades vid 2~8°C i 30 dagar respektive 37°C i 14 dagar. Ingen av satsens prestanda påverkades.

Testindikatorer Accelerationstemperatur och tid	Parameter	Experiment 1		Experiment 2
		T0 tid	2~8℃ 30 dagar	T0 tid	37℃ 14 dagar
Standardkurvaparameter	Amplifieringseffektivitet	97,77 %	99,81 %	98,39 %	98,65 %
	R2	1	1	1	1
Kvantifieringsgräns (30 fg/μL)	CV	11,04 %	13,79 %	9,55 %	14,55 %

Tabell 7 Accelererad stabilitetsresultatanalys

4. 4.Hänvisning

4.1 Chinese Pharmacopoeia Commission (ChPC). Farmakopén för Folkrepubliken Kina (Vol Ⅲ) [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, s. 542-543, 2020.

4.2 NMPA, 2007: Allmänna principer för teknisk granskning av analytisk metodvalidering för kvalitetskontroll av biologiska produkter.

4.3 ICH(2022)《Analytisk metodvalidering Q2》, utkastversion.

Beställningsinformation