บทนำเกี่ยวกับอะพอพโทซิส
อะพอพโทซิสเป็นปรากฏการณ์การตายของเซลล์ที่ได้รับการตั้งโปรแกรมไว้ ซึ่งเกิดขึ้นในระหว่างการพัฒนาเซลล์หรือเมื่อได้รับผลกระทบจากปัจจัยบางอย่าง และถูกกระตุ้นโดยการควบคุมยีนภายในเซลล์และผลิตภัณฑ์ของยีน ในเส้นทางของอะพอพโทซิส เหตุการณ์ต่างๆ จะเกิดขึ้นตามลำดับเวลา ทีละเหตุการณ์ นำไปสู่การแสดงของเวสิเคิลอะพอพโทซิส จากนั้นอะพอพโทซิสก็จะเกิดขึ้น อะพอพโทซิสมีบทบาทสำคัญในการพัฒนาและการสร้างรูปร่างของตัวอ่อน การรักษาจำนวนเซลล์ปกติในเนื้อเยื่อให้คงที่ การป้องกันและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกาย ความเสียหายของเซลล์ที่เกิดจากโรคหรือพิษ การแก่ชรา และการพัฒนาของเนื้องอก และมีคุณค่าทางการรักษาที่มีศักยภาพ
หลักการตรวจจับ
การกระจายตัวของฟอสโฟลิปิดในเยื่อหุ้มเซลล์ปกติไม่สมมาตร ฟอสฟาติดิลเซอรีน (PS) ตั้งอยู่บนผิวด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ในเซลล์ที่มีชีวิต และในระหว่างอะพอพโทซิส เยื่อหุ้มเซลล์จะเกิดการเปลี่ยนแปลง และ PS จะถูกพลิกจากผิวด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ไปยังผิวด้านนอกของเยื่อหุ้มเซลล์ Annexin V จดจำ PS โดยเฉพาะบนพื้นผิวของเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิส ในขณะที่ PS จากเซลล์ที่มีชีวิตตั้งอยู่บนผิวด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ และไม่สามารถจับกับ Annexin V โดยเฉพาะได้
PS ของเซลล์ที่ตายจะพลิกจากพื้นผิวด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์ไปยังพื้นผิวด้านนอกของเยื่อหุ้มเซลล์ และ Annexin V ยังจดจำ PS บนพื้นผิวของเซลล์ที่ตาย ดังนั้น Annexin V จึงไม่สามารถแยกแยะระหว่างเซลล์ที่ตายและเซลล์ที่กำลังจะตายได้ ในทางตรงกันข้าม สีย้อม PI สามารถจับกับ DNA ภายในเซลล์และแยกแยะระหว่างเซลล์ที่ตายและเซลล์ที่มีชีวิตได้ เยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่กำลังจะตายในระยะเริ่มต้นและเซลล์ที่มีชีวิตยังคงสมบูรณ์ และสีย้อม PI ไม่สามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อเข้าสู่เซลล์และจับกับ DNA ได้อย่างอิสระ ดังนั้น สีย้อม PI จึงไม่สามารถติดฉลากเซลล์ที่กำลังจะตายและเซลล์ที่มีชีวิตได้ ในขณะที่สีย้อม PI สามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่ตายและจับกับ DNA ภายในเซลล์ได้ และสีย้อม PI ในเซลล์ที่ตายจะเปล่งแสงสีแดงหลังจากถูกกระตุ้นด้วยเลเซอร์ 488 นาโนเมตร ซึ่งจะรับโดยช่องสัญญาณที่เกี่ยวข้อง ดังนั้นจึงสามารถใช้ Annexin V และ PI พร้อมๆ กันเพื่อแยกแยะระหว่างเซลล์ที่มีชีวิต เซลล์ที่เข้าสู่ภาวะอะพอพโทซิสระยะเริ่มต้น และเซลล์ที่เข้าสู่ภาวะอะพอพโทซิสระยะท้ายหรือเซลล์ที่ตายแล้วได้
รูปที่ 2 หลักการตรวจหา Annexin V / PI
การตรวจจับการไหลของไซโตเมทรี
ความยาวคลื่นกระตุ้นสูงสุดของ FITC คือ 488 นาโนเมตร ความยาวคลื่นการปล่อยสูงสุดคือ 525 นาโนเมตร และตรวจพบการเรืองแสงสีเขียวของ FITC ในช่อง FL1 ความยาวคลื่นกระตุ้นสูงสุดของคอมเพล็กซ์ PI-DNA คือ 535 นาโนเมตร ความยาวคลื่นการแผ่รังสีสูงสุดคือ 615 นาโนเมตร และตรวจพบการเรืองแสงสีแดงของ PI ในช่อง FL2 หรือ FL3 การวิเคราะห์ดำเนินการด้วยซอฟต์แวร์ เช่น CellQuest และวาดกราฟกระจายสองสีโดยใช้ FITC เป็นพิกัดแนวนอนและ PI เป็นพิกัดแนวตั้ง ในการทดลองทั่วไป เซลล์สามารถแบ่งได้เป็น 3 กลุ่มย่อย โดยเซลล์ที่มีชีวิตจะมีเพียงการเรืองแสงพื้นหลังที่มีความเข้มต่ำมาก เซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสในระยะแรกจะมีเพียงการเรืองแสงสีเขียวที่เข้มข้น และเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสในระยะหลังจะมีสีย้อมคู่ด้วยแสงเรืองแสงสีเขียวและสีแดง
รูปที่ 3 การตรวจจับไซโตเมทรีแบบไหล
คำถามที่พบบ่อย
ถาม: การทดสอบอะพอพโทซิสของ Annexin V สามารถนำไปใช้กับพืชหรือแบคทีเรีย (โพรคาริโอต) ได้หรือไม่
A: ใช่ แต่จำเป็นต้องเตรียมโปรโตพลาสต์เนื่องจากเซลล์พืชหรือแบคทีเรีย (โพรคาริโอต) มีผนังเซลล์อยู่ ปริมาณสารละลายย้อมเฉพาะจะต้องจุ่มเซลล์ลงไปเท่านั้น และระยะเวลาในการย้อมจะแตกต่างกันเล็กน้อยสำหรับเซลล์แต่ละประเภท
ถาม: ผลการทดลองจะตัดสินอย่างไร?
A: เซลล์ที่มีชีวิต (Annexin V-/PI-), เซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสระยะเริ่มต้น (Annexin V+/PI-), เซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสระยะปลาย และเซลล์ที่ตาย แสดงผลเป็นบวกสองเท่า (Annexin V+/PI+), นิวเคลียสเปล่า (Annexin V-/PI+)
ถาม: Annexin V และ TUNEL ต่างกันอย่างไร?
A: การติดฉลากปลายนิคด้วยเอนไซม์เทอร์มินัลดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทดิลทรานสเฟอเรส dUTP (TUNEL) เป็นวิธีการย้อมสีที่ใช้เพื่อระบุตำแหน่งการแตกตัวของดีเอ็นเอภายในเซลล์ ซึ่งเป็นลักษณะเด่นของภาวะอะพอพโทซิสในระยะท้าย
การย้อม Annexin V จะรับรู้ระยะเริ่มต้นของอะพอพโทซิสโดยการจับกับสารตกค้าง PS ที่ถูกเปิดเผยภายนอกเซลล์เนื่องจากการสูญเสียความไม่สมมาตรของเยื่อหุ้มเซลล์
ถาม: เป็นไปได้ไหมที่จะทำการทดสอบโดยใช้ Annexin V-FITC เพียงอย่างเดียวโดยไม่ตรวจพบ PI?
A: ใช่ สามารถทำได้ สำหรับตัวอย่างทดสอบพิเศษ เช่น เซลล์เม็ดเลือดแดงที่ไม่มีนิวเคลียส หรือการใช้ยา Doxorubicin (Adriamycin) ซึ่งมีผลรบกวนการตรวจจับ PI สามารถทำการทดสอบโดยใช้ Annexin V-FITC เท่านั้นในทั้งสองกรณี
รายละเอียดสินค้า
| ชื่อสินค้า | หมายเลขสินค้า | ข้อมูลจำเพาะ |
| ชุดตรวจหาอะพอพโทซิส Annexin V-FITC/7-AAD | 40311ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน |
| 40302ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน | |
| ชุดตรวจหาอะพอพโทซิส Annexin V-PE/7-AAD | 40310ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน |
| 40303ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน | |
| ชุดตรวจจับอะพอพโทซิส Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD | 40313ES60 | 100ตัน |
| 40305ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน | |
| 40304ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน | |
| ชุดตรวจจับอะพอพโทซิส Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD | 40312ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน |
| 40306ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน | |
| 40307ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน | |
| 40308ES20/50/60 | 20ตัน/50ตัน/100ตัน |