Pleuropneumonia benzeri organizmalar (PPLO) olarak da bilinen mikoplazmalar, hücre duvarı olmayan, şimdiye kadar keşfedilen en küçük ve en basit prokaryotlardır. 0,1 ila 0,3 μm çapındadırlar, filtrelerden geçebilirler ve yüksek pleomorfizm gösterirler. Memeli hücre kültürlerinde nispeten yaygın ve tespit edilmesi zor bakteri kontaminantlarıdırlar
Mikoplazma kontaminasyonunun hücre kültürleri üzerinde birden fazla olumsuz etkisi vardır ve hücre kültürü uygulamalarında ciddi bir sorun haline gelmiştir. Rutin hücre kültürlerindeki mikoplazma kontaminasyon oranının %15 ila %35 arasında değiştiği muhafazakar bir tahminle tahmin edilmektedir ki bu da deneysel sonuçların güvenilirliğini ciddi şekilde etkilemektedir.
Hücre kültürlerindeki mikoplazma kontaminasyonunun yaklaşık %95'i temel olarak Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis ve Mycoplasma hyorhinis'ten kaynaklanır. Kültür ortamında, mikoplazma kolonileri 'kızarmış yumurta' görünümü oluşturur. Hücre kültürü üst sıvıları ve hücre zarları mikoplazma büyümesi için uygun bir ortam sağlar ve hücrelerin yüzeyinde parazitlenen mikoplazmalar konak hücre zarına nüfuz edebilir.
Mikoplazma kontaminasyonunun başlıca kaynakları şunlardır: hücre kültürü ortamı veya bileşenleri (ortamın ham maddeleri, serum ve diğer reaktifler gibi), laboratuvar personeli, hücre kültürü inkübatörleri, sıvı azot depolama tankları, havadaki partiküller ve aerosoller, antibiyotiklerin aşırı kullanımı, uygun şekilde kapatılmamış hücre kültürleri ve zaten mikoplazma ile kontamine olmuş hücreler.
Bu arada, bu kontaminasyonların karşılık gelen tehlikeleri şunlardır: akış aşağısı saflaştırma sırasında mikoplazmayı etkili bir şekilde giderememe nedeniyle hücre ürünlerinin veya hücreleri bir ortam olarak kullanarak üretilen ürünlerin toplu olarak hurdaya çıkarılmasına yol açma; kontamine malzeme ile temas eden tüm ilgili ekipman ve tesislerin yanı sıra ara veya son ürünleri kirletme; diğer normal hücrelerin mikoplazma ile kontamine olmasına neden olma; mikoplazma kontaminasyonu nedeniyle önemli hücre veya viral tohum bankalarının hurdaya çıkarılmasına yol açma; laboratuvarı mikoplazma kontaminasyonunu ele almak için üretimi veya deneysel işlemleri durdurmaya zorlama; mikoplazma direncinin gelişmesine yol açma ve ortadan kaldırılmasını daha da zorlaştırma; mikoplazma kontaminasyonunun alanını genişletme; ve laboratuvardaki diğer hücre kültürleri için bir tehdit oluşturma.
Bu nedenle, bilimsel araştırmaların normal seyri için gerekli olan hücre kültürü sisteminde mikoplazmanın bulunmadığından emin olmak amacıyla düzenli olarak mikoplazma testi yapılması ve temizlenmesi gerekmektedir.
Mikoplazma Tespit
Mikoplazma nispeten yaygın ancak genellikle çıkarılması zor bir kontaminasyon türüdür. Hücre kültürü içeren biyolojik süreçler için düzenlemeler 'mikoplazma kontaminasyonu olmaması gerektiğini' gerektirir.
- Çin Farmakopesi'nin 2020 baskısı, Cilt III, 'Biyolojik Ürünlerin Üretimi ve Test Edilmesi İçin Hayvan Hücre Substratlarının Hazırlanması ve Kalite Kontrolü', üretimde kullanılan hücreler için mikoplazma testinin Ana Hücre Bankası (MCB), Çalışma Hücre Bankası (WCB) ve Üretim Sonu Hücreleri (EOPC) üzerinde yapılması gerektiğini şart koşmaktadır.
- FDA, Endüstri İçin Rehber: Bulaşıcı Hastalık Endikasyonları İçin Viral Aşı Üretiminde Kullanılan Hücre Substratları ve Diğer Biyolojik Materyallerin Karakterizasyonu ve Kalifikasyonu, mikoplazma kontrolünün ham maddeler, virüs tohumları, işlenmemiş hasat sıvıları ve diğer bu tür materyaller üzerinde yapılması gerektiğini şart koşmaktadır.
- ICH Q5D, 'Biyoteknolojik/Biyolojik Ürünlerin Üretiminde Kullanılan Hücre Substratlarının Türetilmesi ve Karakterizasyonu'nda da mikoplazma kontrolünün ham maddeler, virüs tohumları, işlenmemiş hasat sıvıları ve benzeri diğer malzemeler üzerinde yapılması gerektiği belirtilmektedir.
Şekil 1 Yerel ve uluslararası düzenlemelerin gerektirdiği mikoplazma kontaminasyon test noktaları
Geleneksel mikoplazma tespit yöntemleri esas olarak kültür yöntemleri ve gösterge hücre yöntemlerini içerir. Ancak bu iki yöntemin uzun tespit döngüleri veya hassasiyet sorunları nedeniyle, işletmeler için genişletilmiş üretim veya ürün piyasaya sürme döngülerine yol açarlar. Hücre ve gen terapisinin gelişmesiyle birlikte, endüstrinin mikoplazma tespitinin zamanında yapılması ve hassasiyetine ilişkin gereksinimleri giderek daha katı hale gelmiştir. Kısa raf ömürleri bu kadar uzun tespit sürelerini desteklemek için yetersizdir, bu nedenle hızlı NAT (Nükleik Asit Testi) yöntemi çeşitli mikoplazma tespit yöntemleri arasında öne çıkmıştır.
Şekil 2 Yurt içi ve uluslararası düzenlemelerde listelenen mikoplazma tespit yöntemleri
Yeasen, NAT (nükleik asit amplifikasyon teknikleri) temel alınarak Mycoplasma Gerçek Zamanlı qPCR Tespit Kiti, MycAway™ Plus-Color Tek Adımlı Mikoplazma Tespit Kiti ve GMyc-PCR Mikoplazma Test Kiti dahil olmak üzere bir dizi hızlı mikoplazma tespit kiti geliştirdi.
1.Mycoplasma Gerçek Zamanlı qPCR Tespit KitiÜretim hammaddelerinde, hücre bankalarında, viral tohumlarda, viral veya hücre hasat sıvılarında ve terapötik hücrelerde potansiyel mikoplazma kontaminasyonunun hızlı kalitatif tespiti için bir üründür. Öncelikle biyofarmasötiklerin araştırma, geliştirme, üretim ve salım süreçlerinde kullanılır.
Ürün Nitelikleri
Mevzuata Uygunluk: EP2.6.7, JP G3 ve USP 63 farmakopelerinin gerekliliklerine göre valide edilmiş olup, uluslararası yetkili kuruluşların standartlarını karşılamaktadır.
Denetim Uyumluluğu: Ürün üretimi ISO13485 kalite yönetim sistemi standartlarına uygun olup kapsamlı denetim dokümanları ile desteklenmektedir.
Kalite Güvencesi: Kit için gerekli olan tüm enzim hammaddeleri kendi üretimimiz olup endüstriyel hale getirilmiş olup, istikrarlı tedarik sağlanmaktadır.
Teknik Deneyim Birikimi: TaqMan yönteminde sağlam bir teknik temel bulunmakta olup, kit duyarlılığı 10 CFU/mL ve altına kadar ulaşabilmektedir.
Ürün Performansına Odaklanın: Çift blokajlı antikorlar içeren Taq enzim antikor kütüphanesi, kitin özgüllüğünü, duyarlılığını ve stabilitesini artırır.
Ürün Özellikleri
Çoklu Algılama Türleri: Optimize edilmiş TaqMan probları 183'e kadar mikoplazma türünü tespit edebiliyor.
Kullanımı Kolay: Örnek hazırlama ve test için toplam süre 3 saatten azdır ve bu sayede kültür yöntemleriyle ilişkili 28 günlük bekleme süresine gerek kalmaz.
Yüksek Hassasiyet: Tespit sınırı 10 CFU/mL kadar düşük olup, bu da onu doğrudan kültür yöntemlerine uygulanabilir bir alternatif haline getirir.
Yüksek Özgüllük: Primer ve problar 16S rRNA'yı hedef alacak şekilde tasarlanarak, klostridya ve laktobasil gibi yakın ilişkili türlerle çapraz reaksiyon oluşmaması sağlanmaktadır.
Yüksek Güvenlik: Kit içerisindeki pozitif kontrol (PC) bulaşıcı olmayıp kontaminasyon riskini tamamen ortadan kaldırmaktadır.
Güçlü Girişim Direnci: Dahili kontrolün (IC) tanıtılması, reaksiyon hazırlamada numune girişimini ve anormallikleri dışlamaya yardımcı olur ve böylece yanlış negatif sonuçların etkili bir şekilde önlenmesini sağlar.
Şekil 3 Mycoplasma Gerçek Zamanlı qPCR Algılama Kiti Kullanılarak Mycoplasma Algılama İş Akışı
2.MycAway™ Plus-Color Tek Adımlı Mikoplazma Tespit KitiBenzersiz bir izotermal amplifikasyon teknolojisi kullanır ve daha yüksek renk ayrımı sunar. Mavi-mordan (negatif) gök mavisine (pozitif) geçiş çıplak gözle daha kolay fark edilebilir. Ek olarak, yanlış pozitiflerin oluşumunu ortadan kaldırmak için anti-kontaminasyon bileşenleri içerir.
Şekil 4: MycAway™ Plus-Color Tek Adımlı Mikoplazma Tespit Kiti Kullanılarak Mikoplazma Tespiti için İşletim Prosedürü
3.GMyc-PCR Mikoplazma TespitKitGeleneksel tek adımlı PCR tespit yöntemlerinden farklı olarak, primer sayısı bir çiftten üç çifte çıkarılarak yuvalanmış PCR amplifikasyonu için mikoplazma 16S ve 23S rRNA'nın korunan bölgeleri hedeflenir. Bu, yalnızca spesifik olmayan ürünleri azaltmakla kalmaz, aynı zamanda ürünün duyarlılığını da önemli ölçüde artırarak, mikoplazmanın tek bir kopyası kadar azının tespit edilmesine olanak tanır.
、
Şekil 5 GMyc-PCR Mikoplazma Test Kiti Kullanılarak Mikoplazma Tespiti için İşletim Prosedürü
Mikoplazma Temizleme
Hücre kültürü sürecinde, düzenli testler büyük ölçekli mikoplazma kontaminasyonunu etkili bir şekilde önleyebilir. Ancak hücreler zaten mikoplazma ile kontamine olmuşsa, derhal ele alınmaları gerekir. En iyi uygulama, kontamine olmuş hücreleri yüksek basınç altında sterilize etmek ve ardından diğer temiz hücre hatlarını kontamine etmekten kaçınmak için atmaktır. Kontamine olmuş hücreler özellikle değerliyse ve mikoplazma kontaminasyonunun giderilmesi gerekiyorsa, bu hedefe ulaşmak için bir antibiyotik kombinasyonu kullanılabilir. Mikoplazmalarda hücre duvarı olmadığından, geleneksel antibiyotikler genellikle bunlara karşı etkisizdir. Bu nedenle, uygun bir mikoplazma giderme reaktifi seçmek çok önemlidir.
Yeasen'in MycAway™ Tedavisi (1000×), mikoplazma üzerinde antimikrobiyal etkiye sahip üç bileşen içeren karma bir antibiyotik preparattır: kinolonlar, tetrasiklin türevleri ve makrolid antibiyotikler. Bu mikoplazma giderme reaktifi, hücrelere zarar vermeden DNA sentezini ve mikoplazma büyümesi için gerekli proteinlerin üretimini engelleyerek etkili bir mikoplazma temizliği sağlar. Hücre kurtarmayı en üst düzeye çıkarır ve mikoplazma kontaminasyonundan kaynaklanan kayıpları en aza indirir.
Ürün Özellikleri
Düşük Toksisite: Hücreler için minimum toksisite, transfeksiyon ve canlılık testleri gibi sonraki hücre deneylerine müdahale edilmemesini sağlar.
Yüksek Stabilite: Reaktif -20°C’de uzun süre saklanabilir ve yüksek etkinliğini koruyabilir.
Kullanımı Kolay: Ürünü mikoplazma ile kontamine olmuş kültür ortamına ekleyin ve inkübe edin.
Hızlı Etkili: 'Anında Sonuçlar', etkileri 3 gün gibi kısa bir sürede görülür.
Geniş Spektrum: Laboratuvarlarda bulunan mikoplazma türlerinin büyük çoğunluğunu yok edebilmektedir.
Şekil 6.Mikoplazma Giderme Reaktifi Sitotoksisite Testinin İllüstrasyonu
Mikoplazma Önleme
Hücre kültürü sürecinde mikoplazma kontaminasyonu sıklıkla meydana gelir. Ancak, benzersiz özellikleri nedeniyle çıplak gözle veya mikroskobik ekipmanla tespit edilmesi zordur. Bu nedenle, mikoplazma önlemede iyi bir iş çıkarmak özellikle önemlidir. Mikoplazma kontaminasyonunun etkili bir şekilde önlenmesi, kültür ortamına mikoplazma önleme reaktifleri eklenerek sağlanabilir.
Şu anda laboratuvarlardaki mikoplazma çoğunlukla şunlardan kaynaklanır: hücreler arası çapraz kontaminasyon, çalışma ortamının veya laboratuvar ekipmanının kontaminasyonu, deneyciler tarafından uygulanan zayıf aseptik teknikler, kontamine kültür ortamı veya reaktifleri ve mikoplazma kontaminasyonu olan orijinal dokular veya organlar. Yeasen tarafından geliştirilen mikoplazma önleme ürün serisi, basitlik, kolaylık ve yüksek stabiliteye sahiptir ve bu da onu rutin hücre hattı kültürlerinde mikoplazma önleme için çok uygun hale getirir.
Ürün Bilgileri
| Ürün | Katalog Numarası | Ürün Adı | ürün özellikleri |
| Örnek ön işlem kiti | 18461ES | 25T/100T | |
| 18467ES | MolPure® Mag48 Örnek Hazırlama Kiti FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Nükleik asit çıkarma aleti | 80511ES | 48 Kanallı Otomatik Nükleik Asit Çıkarıcı | 48 Kanal |
|
Mikoplazma Tespit Kiti | 40619ES | MycAway® Mycoplasma Gerçek Zamanlı qPCR Tespit Kiti (2G)
| 25T/100T |
| 40612ES | 25T/100T | ||
| 40601ES | 10deneme/20deneme | ||
| Mikoplazma Giderme Reaktifi | 40607ES | Benim UzaktaT.M. Tedavi (1000×) - Mikoplazma Giderme Reaktifi | 1mL/5×1mL
|
|
Mikoplazma Önleme Reaktifi | 40608ES | Benim UzaktaT.M. Profilaktik (2000×) -Mikoplazma Önleme Reaktifi | 1mL/5×1mL
|
| 40605ES | Benim UzaktaT.M. Sprey (Kullanıma hazır) | 500mL/2×500mL/10×500mL
| |
| 40609ES | MycGuardT.M.-1 Çözelti (100×), CO2 İnkübatörünün Su Banyosunun Dezenfeksiyonu İçin | 100mL | |
| 40610ES | MycGuardT.M.-2 Solüsyon (500×), Sıradan Su Banyosunu Dezenfekte Etmek İçin | 100mL |