Nükleik asit kontaminasyonu, moleküler tanı teknolojilerinin ilerlemesinde uzun zamandır önemli bir engel teşkil etmektedir. Daha hassas tanı yöntemleri geliştirildikçe, enzimlerin ve proteinlerin daha yüksek saflığına olan talep artmıştır. Protein üretimindeki temel zorluklardan biri, nükleik asit kontaminasyonunu etkili bir şekilde ortadan kaldırmaktır. Nükleik asitlerin varlığı, protein işlevini ve aktivitesini tehlikeye atabilir ve potansiyel olarak spesifik olmayan bağlanma, enzim aktivitesi inhibisyonu veya artan arka plan sinyalleri gibi sorunlara yol açabilir ve bu da nihayetinde tanı sonuçlarının doğruluğunu etkiler.
Sonuç olarak, protein üretimi sırasında nükleik asit giderimi için verimli proseslerin geliştirilmesi hem kritik hem de gereklidir.
Yıllar süren teknolojik araştırmaların ardından Yeasen Biotechnology, verimli nükleik asit giderimi için kapalı entegre bir yöntem geliştirdi. Bu süreç hücre geçirgenliğini optimize eder, anyon-katyon değişim kolonu saflaştırmasını, mikrofiltrasyonu ve ultrafiltrasyon adımlarını içerir ve kalıntıların tam süreç izlenmesini içerir. Bu entegre yaklaşım, nükleik asit kontaminasyonunun maksimum düzeyde giderilmesini sağlayarak, ultra düşük DNA kalıntılarına sahip moleküler enzimlerin saflaştırılmasını mümkün kılar.
Protein Üretiminde DNA Kontaminasyonunu Önlemeye Yönelik Kapsamlı Stratejiler
DNA kontaminasyonu, biyolojik ürünlerin üretiminde yaygın bir zorluk olup, saflıklarını, kalitelerini ve deneysel sonuçların doğruluğunu önemli ölçüde etkiler. Protein preparatlarında DNA bulunması, yanlış deneysel sonuçlara, verilerin çarpıtılmasına ve potansiyel olarak yanlış pozitif olasılığının artmasına yol açabilir. Protein üretimiyle uğraşan araştırmacılar ve üreticiler için, DNA kontaminasyonunu önlemek ve azaltmak için etkili stratejiler uygulamak esastır. Bu makale, özellikle havadaki kontaminasyon olmak üzere DNA kontaminasyonundan nasıl kaçınılacağını araştırıyor ve protein örneklerinden DNA'yı etkili bir şekilde çıkarmak için yöntemleri özetliyor.
BEN. Havadaki DNA Kontaminasyonunun Önlenmesi
Havadaki DNA kontaminasyonu, özellikle mikrobiyal ve partikül kontrolünün elzem olduğu ortamlarda, protein üretiminde kritik bir endişe olmaya devam etmektedir. Havadaki DNA kontaminasyonu riskini en aza indirmek için aşağıdaki stratejiler kullanılmalıdır:
| 1. Temiz Oda Ortamı Oluşturun Temiz bir odada protein üretimi yapmak, DNA kontaminasyonuna neden olabilecek havadaki partikülleri ve mikropları en aza indirmek için gerekli kontrollü ortamı sağlar. Temiz odalar, kirletici içermeyen bir atmosfer sağlamak için belirli temizlik standartlarını karşılamalıdır. | 2. HEPA Filtreleme Sistemlerini Uygulayın HEPA filtrelerle donatılmış hava temizleme sistemleri, toz, mikrobiyal kirleticiler ve DNA parçaları gibi havadaki partikülleri yakalamak için gereklidir. Bu filtreler, üretim tesisi genelinde temiz havanın korunmasına yardımcı olur. |
| 3. Pozitif Basınç Ortamını Koruyun Pozitif basınç ortamları, kontrol edilen alanın dışından kirli havanın girmesini engeller. Üretim alanının içinde dış ortamlara kıyasla daha yüksek hava basıncının korunması, herhangi bir sızıntının havanın içeri girmesine değil, dışarı kaçmasına yol açmasını sağlar. | 4. Rutin Temizlik ve Dezenfeksiyon Protokolleri Üretim alanının uygun dezenfektanlar (nükleazlar veya klor bazlı temizleyiciler gibi) kullanılarak düzenli olarak temizlenmesi, havadaki DNA'yı parçalayarak kontaminasyon riskini azaltabilir. Bu, özellikle yüksek temaslı alanlarda ve protein üretim ekipmanlarına yakın yüzeylerde önemlidir. |
| 5. Personel Hareketini Sınırla Temiz oda ortamlarında personel hareketini en aza indirmek, insan etkileşimi yoluyla kirleticilerin girme olasılığını azaltır. Belirlenen personel, maruziyeti kontrol etmek için giriş ve çıkışla ilgili katı protokolleri izlemelidir. | 6. Hava Kalitesi İzleme Temiz odadaki hava kalitesinin, mikrobiyal sayımlar ve partikül seviyeleri dahil olmak üzere izlenmesi, üretim standartlarına sürekli uyumun sağlanması için önemlidir. Ortamın temizliğini değerlendirmek için hava örnekleyiciler ve partikül sayaçları kullanılabilir. |
| 7. Tek Kullanımlık Malzemeleri Benimseyin Protein üretiminde tek kullanımlık sarf malzemelerinin kullanılması, yeniden kullanılabilir ekipmanlarda yaygın olan çapraz bulaşma riskini önemli ölçüde azaltır. | 8. Kapalı Üretim Prosesleri Biyoreaktörler veya mühürlü odalar gibi kapalı sistemler, açık ortama maruz kalmayı en aza indirir. Bu, özellikle fermantasyon ve protein saflaştırma gibi kritik aşamalarda havadan DNA kontaminasyonu riskini azaltır. |
| 9. Aerosol Oluşumunu Önleyin Protein üretimi sırasında aerosol oluşumu havadaki DNA'nın yayılmasını kolaylaştırabilir. Sıvıların dikkatli bir şekilde taşınması ve çalkalanmadan aktarılması gibi önlem tedbirleri aerosol oluşumunu en aza indirebilir. | 10. Nükleazlar Kullanımı Yüzeylerin ve ekipmanların kullanım öncesi ve sonrasında nükleazlarla işlenmesi, hücre lizi veya filtrasyon gibi işlemlerden sonra geride kalabilecek kalıntı DNA'yı parçalayabilir. |
| 11. Çevresel İzolasyonu Uygulayın Protein saflaştırma ve formülasyonu gibi yüksek riskli işlemlerde izolatörlerin veya eldiven kutularının kullanılması, işlemi havadaki kirleticilerden izole ederek ekstra bir koruma katmanı sunar. | 12. Özel Ekipman ve Araçlar Sadece protein üretimi için kullanılan özel ekipmanların kullanılması, diğer proseslerde DNA veya nükleik asitlere maruz kalmış olabilecek alet ve ekipmanlardan kaynaklanabilecek çapraz kontaminasyonu önler. |
| 13. Acil Kirlenme Müdahale Planı Kazara DNA kontaminasyonunu yönetmek için etkili bir yanıt planı olmalıdır. Protokol, yayılmayı önlemek ve kontaminasyonun etkisini en aza indirmek için hızlı tanımlama, sınırlama ve iyileştirme adımlarını içermelidir. | 14. Çalışan Eğitimi Personelin DNA kontaminasyon riskleri ve uygun işleme tekniklerinin önemi konusunda sürekli eğitilmesi, en iyi uygulamaların uygulanmasını ve kontaminasyon kontrol protokollerine uyulmasını sağlar. |
II. Proteinlerden DNA Kirliliğini Giderme
Protein saflaştırması sırasında, herhangi bir kalıntı DNA kontaminasyonunun giderilmesi protein kalitesinin korunması için kritik öneme sahiptir. Protein örneklerinden DNA'yı ortadan kaldırmak için yaygın olarak birkaç teknik kullanılır:
| 1. Hafif Hücre Lizis Yöntemleri Tahribatsız lizis tamponları, DNA'nın kırılmasını en aza indirirken proteinlerin serbest bırakılmasını sağlar. Bu yaklaşım, DNA'nın ayrım gözetmeksizin tahrip edilmesini önleyerek protein örneğinin kirlenme olasılığını azaltır. | 2. Optimize Edilmiş Lizis Koşulları Hücre lizi sırasında pH ve iyonik güç gibi faktörlerin ayarlanması, DNA'nın çözünmesini önleyebilir ve böylece elde edilen numunedeki kirletici DNA miktarını azaltabilir. |
| 3. Nükleaz İnhibisyonu Fenilmetilsülfonil florür (PMSF) gibi proteaz inhibitörlerinin kullanımı, hücreler içindeki nükleazların aktivitesini önleyerek, lizis sırasında daha kontrollü ve seçici DNA bozunmasına olanak tanıyabilir. | 4. Ozmotik şok Ozmotik şok, hücreleri ani bir ozmotik basınç farkı olan bir çözeltiye yerleştirerek lize etmek için kullanılan nazik bir yöntemdir. Bu, DNA salınımını azaltmaya yardımcı olarak daha temiz protein preparatlarına yol açabilir. |
| 5. Enzimatik Lizis Lizozim gibi enzimlerin bakteri hücre duvarlarını parçalamak için kullanılması, yalnızca hücre zarını hedef alan ve hücresel içeriklerin serbest bırakılması sırasında DNA kontaminasyonu riskini azaltan kontrollü bir lizis yöntemidir. | 6. Lizis Sonrası Tedavi Hücreler lize edildikten sonra, numunenin hemen soğutulması, aksi takdirde çözeltide daha fazla DNA bozulmasına yol açacak olan nükleaz aktivitesinin azaltılmasına yardımcı olabilir. |
III. Nükleik Asit Giderimi İçin Gelişmiş Yöntemler
Kromatografi veya afinite bazlı yöntemlerin, aşağı akış işlemlerinde kullanılması, protein preparatlarından eser miktardaki DNA kirleticilerinin daha da uzaklaştırılmasını sağlayabilir. Anyon değişimi ve katyon değişimi kromatografisi, protein örneklerinden DNA kontaminasyonunu gidermek için iki köklü tekniktir. Her ikisi de DNA'yı seçici olarak gidermek için nükleik asitler ve yüklü yüzeyler arasındaki etkileşime dayanır.
| 1. Anyon Değişim Kolonları Anyon değişim kolonları, negatif yüklü nükleik asitleri çekmek ve bağlamak için pozitif yüklü sabit fazlar kullanır. Elüsyon tamponunun tuz konsantrasyonunu ayarlayarak, nükleik asitler protein preparatından seçici olarak çıkarılabilir. | 2. Katyon Değişim Kolonları Belirli koşullarda, katyon değişim kolonları nükleik asitleri uzaklaştırmak için de kullanılabilir. Tuz konsantrasyonunu artırarak veya pH'ı değiştirerek, nükleik asitler kolondan rekabetçi bir şekilde elüe edilebilir. |
| 3. Ultrafiltrasyon Ultrafiltrasyon, proteinleri nükleik asitlerden ayırmak için seçici membran filtrasyonunu kullanır ve böylece saflaştırma adımları sırasında DNA'nın etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlar. | 4. Jel Filtrasyon Kromatografisi Jel filtrasyonu, molekülleri boyutlarına göre ayıran bir boyut dışlama kromatografisi tekniğidir. Proteinlerden daha büyük olan nükleik asitler etkili bir şekilde ayrılır ve geride saf protein örnekleri kalır. |
IV. Personelden Kaynaklanan DNA Kontaminasyonunun Azaltılması
Personel, DNA kontaminasyonunun protein üretim süreçlerine potansiyel olarak girmesinde önemli bir rol oynar. Aşağıdaki önlemler bu riski azaltmaya yardımcı olabilir:
| 1. Kapsamlı Personel Eğitimi Tüm personele DNA kontaminasyon kontrolünün önemi ve kontaminasyonu önlemeye yönelik en iyi uygulamalar konusunda eğitim verilmelidir. | 2. Kişisel Koruyucu Donanım (KKD) Personel, insan temasından kaynaklanan DNA kontaminasyonu riskini en aza indirmek için laboratuvar önlüğü, eldiven, maske ve gözlük gibi uygun KKD'leri giymelidir. |
| 3. El Hijyeni Protokolleri DNA'nın ellerden yüzeylere ve ekipmanlara transferini azaltmak için sık sık el yıkamak ve alkol bazlı dezenfektanların kullanımı esastır. | 4. Giyim ve Ayakkabı Değişiklikleri Özel iş kıyafetleri ve ayakkabıları giymek, üretim alanının dışından DNA kontaminasyonunun gelmesini önler. |
| 5. Sıkı İş Davranışı Düzenlemeleri DNA'nın tükürük, yiyecek parçacıkları veya damlacıklar yoluyla bulaşmasını önlemek için personel protein üretim alanında yemek yemekten, içmekten veya konuşmaktan kaçınmalıdır. | 6. Çevresel İzleme Üretim alanında DNA kontaminasyonunun olmadığından emin olmak için hava, yüzey ve ekipman kontrolleri de dahil olmak üzere düzenli çevresel izleme yapılmalıdır. |
Çözüm
Yüksek kaliteli, kirlenmemiş proteinlerin üretimini garantilemek için, DNA kontaminasyonu kontrolüne yönelik kapsamlı bir yaklaşım gereklidir.Sıkı çevre kontrolleri benimseyerek, optimize edilmiş saflaştırma yöntemlerini kullanarak ve personel eğitimine vurgu yaparak, DNA kontaminasyonuyla ilişkili riskler önemli ölçüde en aza indirilebilir. Bu uygulamalar, araştırma ve endüstriyel uygulamalarda protein ürünlerinin bütünlüğünü ve güvenilirliğini korumak için çok önemlidir ve nihayetinde biyolojik ürün geliştirmenin ilerlemesine katkıda bulunur.
İlgili Ürünler
1. UCF.ME Urasil DNA Glikosilazı (UDG/UNG), ısıya duyarlı
2. UCF.ME Fare RNaz İnhibitörü
Ürün avantajları
- UCF.ME'nin ultra düşük kalıntısı—E. coli genomik DNA kalıntısı <0,1 kopya/U;
- Düşük nükleaz kalıntısı—Kalıntı ekzonükleaz, çentik enzimi veya RNaz yok;
- Güçlü sindirim kabiliyeti—0,05 U/T, 105 kopya/T dU-DNA ürününü sindirebilir;
- İyi termolabilite—50°C'de 10 dakika, 55°C'de 5 dakika veya 95°C'de 5 dakika gibi herhangi bir koşulda tam inaktivasyon;
- RT-qPCR reaksiyon sistemleriyle uyumludur—Yüksek giriş seviyelerinde bile (2U/20μL reaksiyon sistemi) tespit sistemine etki etmez.
（1）Düşük Kalıntı Nükleazlar: Kalıntı Ekzonükleaz, Çentik Enzimleri veya RNazlar Yok
Şekil 1. Nükleaz kalıntısı test sonuçları
(2) E. coli genomik DNA kalıntısı < 0,1 kopya/U
Şekil 2. E.coli genomik DNA kalıntısı test sonuçları
Sipariş bilgileri
| Kedi: | İsim | Başvuru |
| Hieff UNICON UCF. ME™ Gelişmiş Hotstart Taq DNA Polimerazı | PCR | |
| 14608 | Hifair UCF.ME™ V Ters Transkriptaz (200 U/μL) | RT-PCR |
| UCF.ME™ Urasil DNA Glikosilazı (UDG/UNG), ısıya duyarlı, 1 U/μL | RT-PCR | |
| UÇF.ME™ Fare RNaz İnhibitörü (40 U/µL) | RT-PCR | |
| Hifair™ V2 Multiplex Tek Adımlı RT-qPCR Prob Kiti (UDG Plus, GC Enhancer Plus) | RT-PCR | |
| Hieff Unicon® Pure Pro U+ qPCR Karışımı (Bir Tüp) | qPCR | |
| Hieff NGS™ ds-cDNA Sentez Kiti | mNG'ler | |
| 13501 | Hieff NGS™ ds-cDNA Sentez Kiti (gDNA sindirici artı) | mNG'ler |
| Hieff NGS™ OnePot Flash DNA Kütüphane Hazırlık Kiti | mNG'ler | |
| 13490 | Hieff NGS™ OnePot ll Illumina için DNA Kütüphane Hazırlık Kiti | mNG'ler |
| 12946 | 10x Hieff NGS™ 1. cDNA Sentez Kiti | Patojen İçin tNGS |
| 4x Hieff™ Multiplex RT-PCR Kiti | Patojen İçin tNGS | |
| 4x Hieff™ Multiplex PCR Ana Karışımı | Patojen İçin NGS | |
| 12977 | 4x Hieff™ Multiplex PCR Ana Karışımı 2.0 | Patojen İçin NGS |
| E.coli Konak Hücre DNA Kalıntısı Tespit Kiti (2G) | Kalite Kontrol | |
| MolPure™ Manyetik Kalıntı DNA Örnek Hazırlama Kiti | Kalite Kontrol |